miR-449b 通過E2F3 -p53 途徑抑制子宮內膜腺癌細胞HEC-1 -B 的生長

陳慧君 黃亦波 林蓉蓉 鄭飛云

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)又稱子宮體癌，是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，在全球占女性生殖道惡性腫瘤20% ～30%，發生率呈逐年上升趨勢［1］。有研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發生、發展過程中發揮作用［2］。本研究通過在子宮內膜腺癌HEC -1 -B細胞中過表達miR-449b，初步探討其對子宮內膜腺癌HEC-1 -B 細胞的細胞增殖和凋亡的影響及其作用的分子途徑。

材料與方法

1.材料:胎牛血清、Opti -MEM、DMEM 培養液(Gibco 公司)，lipofectamine 2000 轉染試劑(Invitrogen 公司)，hsa -miR-449b mimics、miRNA mimics 陰性對照(上海吉瑪公司)，hsa-miR-449b 上游引物及U6 上游引物(上海生工公司)，SYBR GREEN(Toyobo 公司)，CCK-8 試劑、凋亡試劑盒、結晶紫細胞染色液(碧云天生物技術研究所)，Trizol 試劑、miRNA反轉錄及實時熒光定量PCR 試劑盒(Invitrogen 公司)，兔抗E2F3 抗體、鼠抗p53 抗體(Abcam 公司)，鼠抗β-actin 抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體(Bioworld 公司)

2.方法:(1)細胞培養及轉染:HEC-1 -B 細胞購自中科院上海細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM 培養，隔天更換培養液。轉染前24h，以2.5 ×105/ml 的細胞數接種于6 孔板(96 孔板接種細胞數為2500/ml)，置37℃，5%飽和濕度CO2的培養箱過夜后，按照lipofectamine 2000 說明書分別轉染has-miR-449b mimics 和miRNA mimics 陰性對照。轉染完成后繼續培養來完成后續實驗。本實驗分為實驗組(miR -449b mimics 轉染組)和NC 組(miRNA mimics 陰性轉染組)。(2)RNA 的提取及實時熒光定量PCR 檢測miR -449b 的水平:轉染48h 后，Trizol 手工法提取細胞總RNA，保證A260/A280 在1.8 ～2.0 范圍內。SYBR GREEN 試劑盒內提供RT及qPCR 通用引物，操作步驟按其說明書進行，先將miRNA 加多聚A 尾，反轉錄為cDNA。qPCR 反應體系為10μl:SYBR GREEN Mix5μl、cDNA 模板1μl、qPCR 通用引物1μl、上游引物1μl、ddH2O 2μl。miRNA-449b 特異上游引物序列為5' -AGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGC-3'，以U6 為內參物，上游引物序列為5' - CGCAAGGATGACACGCAAATTC -3'。反應條件:95℃變性3min 后，95℃5s，62℃40s 擴增40 個循環。結果CT 值以2-ΔΔCt方法，來表示miR -449b 的表達量。(3)細胞增殖活性檢測:將HEC-1 -B 細胞接種于96 孔板，2500個細胞/孔，培養基100 微升/孔，每組設6 個復孔，24h 后轉染。轉染24、48、72h 后，每孔更換100μl 無雙抗血清的DMEM培養基，加入10μl CCK -8 原液，避光置于培養箱孵育，每30min 酶標儀檢測450nm 波長的吸光度，直至NC 組吸光度值接近1。(4)細胞克隆形成實驗:轉染72h 后，胰酶消化、離心、重懸，細胞計數后，以500 個細胞/孔接種于6 孔板(培養基2 毫升/孔)，輕輕搖動混勻，置于培養箱培養，每2 天更換培養液，約14 天后，肉眼可見6 孔板底部成團的克隆團，停止繼續培養。棄培養液，PBS 洗3 遍，4%多聚甲醛固定15min后，結晶紫避光染色30min，PBS 洗3 遍，空氣干燥，相機拍照，計克隆數。每孔加入500μl 34%冰乙酸萃取，100 微升/孔加至96 孔板中檢測590nm 波長的吸光度。(5)細胞凋亡檢測:6孔板鋪板，轉染72h 后，制備單細胞懸液，PBS 洗滌、離心2次，根據Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒的說明書對細胞進行染色后，用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。(6)蛋白質印跡(Western blot)法檢測E2F3 和p53 表達:采用常規Western blot 方法，抗體濃度按其說明書稀釋，經辣根過氧化物酶催化底物發光，系統照相，Image Lab 軟件分析E2F3 和p53 表達變化(表達量以光密度數值表示)。

3.統計學方法:采用SPSS 19.0 統計學軟件。每組實驗至少重復3 次，結果以均數±標準差(±s)表示。各組數據比較運用單因素方差分析，進行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.轉染后miR-449b 表達上調:轉染48h 后，通過實時熒光定量PCR 檢測miR-449b 的表達量。采用2-ΔΔCt法計算miR -449b 表達量:610.84 ±41.35。實驗組miR-449b 表達量高于NC 組，差異有統計學意義(P ＜0.05，圖1 ～圖4)。

2.miR-449b 抑制細胞增殖:分別轉染24、48 和72h 后用CCK - 8 試劑盒檢測實驗組和NC 組的HEC-1 -B 細胞增殖活性，結果顯示，轉染24h:實驗組為0.95 ±0.04，NC 組為1.00 ±0.06;轉染48h:實驗組為0.84 ±0.05，NC 組為0.98 ±0.04;轉染72h:實驗組為0.58 ±0.07，NC 組為1.02 ±0.05。各時間點實驗組細胞增殖活性均較NC 組弱，組間比較，差異有統計學意義(P ＜0.05，圖5)。

圖1 U6 溶解曲線

圖2 miR-449b 溶解曲線

圖3 擴增曲線

圖4 實時熒光定量PCR 檢測miR-449b表達情況(2 -ΔΔCt法)

圖5 轉染24、48、72h 后細胞增殖情況(450nm 波長)

3.miR-449b 抑制細胞克隆形成:HEC -1 - B細胞培養14 天后，結晶紫染色結果如圖，實驗組細胞克隆形成能力下降。用冰醋酸萃取后，測590nm 吸光度結果顯示，實驗組為0. 51 ± 0. 01，NC 組為0.98 ±0.27，差異有統計學意義(P ＜0.05，圖6)。

圖6 細胞克隆形成實驗

4.miR-449b 促進細胞凋亡;轉染72h 后流式細胞儀測細胞凋亡情況。結果顯示，實驗組為24.70% ±0.56%，NC 組為10.90% ±0.64%。實驗組細胞凋亡增多，差異有統計學意義(P ＜0.05，圖7)。

圖7 流式細胞儀測細胞凋亡情況

5. E2F3 和p53 的表達情況:實驗組較NC 組E2F3 表達水平下調，p53 表達水平上調(圖8)。

圖8 E2F3、p53 表達情況

討 論

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為22 ～25 個核苷酸的內源性小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，功能是通過與靶基因3UTR 上的結合位點互補結合，在轉錄后調控基因的表達，在細胞生長、分化及凋亡等多種生物過程中發揮作用［3，4］。隨著miRNA 研究的深入，近年miRNA 與腫瘤的相關性越來越受到人們的重視，有研究報道癌組織和癌細胞中miRNA 表達差異明顯，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展［2，5］。子宮內膜癌是發生于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，分為雌激素依賴型(Ⅰ型)和非雌激素依賴型(Ⅱ型)，目前關于miRNA 在子宮內膜癌中的生物學影響及作用機制研究甚少。

miR-449 是近年新發現的一種miRNA，通過轉錄后調控基因表達，參與多種疾病的發生、發展［6］。miR-449 既能通過自動調節反饋機制調控細胞周期負反饋調控通路，又能直接靶向識別及調控靶基因的表達，對細胞周期相關基因CDK 家族進行調控。在細胞增殖方面，Marcet 等［7］研究顯示miR -449 能影響Notch 信號通路，抑制細胞增殖。而在肝癌細胞系中，Zhang 等［8］發現miR -449 通過阻礙脂代謝相關的SIRT1 通路抑制細胞增殖。在胃癌中，Bou Kheir等［9］研究顯示miR -449 的直接靶基因有GMNN、MET、CCNE2、SIRT1，通過與靶基因的3UTR 結合沉默靶基因的表達，間接上調細胞p53 和p21 的表達，進而抑制細胞的增殖能力。在細胞凋亡方面，Lize等［10］研究發現miR-449 和miR-34 調節E2F-p53負反饋循環系統的平衡來誘導細胞凋亡。Feng 等［11］研究顯示miR-449 調節反饋機制調控細胞周期負反饋調控通路CDK -Rb -E2F1，miR -449 下調pRb-E2F1 的表達，靶向沉默CDK6 和CDK25A，導致pRb 脫磷酸化。而在婦科腫瘤方面，Jang 等［12］研究發現miR-449 在卵巢和子宮透明細胞癌中低表達。

筆者之前的研究［13］通過基因芯片的篩查發現miR-449a 及miR -449b 在子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中的表達存在差異，這與其在胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌等多種腫瘤中表達一致［8，9，14］。并且在后續研究［15］中，我們發現miR -449a 能抑制HEC -1 -B 細胞的生長。而本研究同樣以子宮內膜腺癌HEC -1 - B 細胞為對象，通過轉染has-miR-449b mimics 使miR -449b 表達上調，通過實時熒光定量PCR 驗證HEC -1 -B 細胞轉染后miR-449b 表達量明顯高于NC 組，證實細胞轉染成功。CCK-8 和細胞克隆形成實驗顯示細胞增殖明顯受抑制，說明miR-449b 能抑制HEC -1 -B 細胞增殖。流式細胞儀測細胞凋亡顯示細胞凋亡增加明顯，說明miR-449b 能促進HEC -1 -B細胞凋亡。

E2F3 屬于轉錄因子E2F 家族，參與調控細胞周期由G 期進入S 期，促進細胞增殖及惡性轉化，是細胞周期重要的轉錄因子［16］。E2F3 可以和DP 蛋白結合形成二聚體，進而與靶基因的啟動子結合來調控轉錄。E2F3 活性受到腫瘤抑制因子Rb 磷酸化的直接調控。E2F3 與去磷酸化的Rb 結合而失活，使細胞周期于G1/S 期停滯，細胞增殖停止;E2F3 被釋放而活化時，細胞周期順利度過G1/S 期，促進細胞增殖［17］。E2F3 這種作用也同樣促進腫瘤細胞異常增殖，在腫瘤發展過程中起重要作用［18］。而p53 屬于p53 基因家族，是一種抑癌基因，具有阻滯細胞周期、修復受損DNA、促進細胞凋亡、抑制細胞過度增殖等功能。有研究表明過表達miR - 34 家族能調節E2F-p53 的平衡來誘導細胞周期停滯和促進細胞凋亡［10］。本研究用Western blot 方法證實轉染miR -449b 后E2F3 蛋白的表達下調及p53 蛋白的表達上調，表明miR-449b 可調節E2F3 -p53 負反饋循環系統，可能參與其信號通路的轉導，影響細胞周期過程，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究證明miR -449b 能抑制子宮內膜腺癌HEC-1 -B 細胞的增殖，促進HEC -1 -B細胞的凋亡。轉染miR -449b 后E2F3 的表達下調和p53 的表達上調，說明miR - 449b 可作用于E2F3 -p53 負反饋循環系統來調控影響細胞周期，在子宮內膜腺癌的發生、發展中起作用，且有可能成為子宮內膜腺癌靶向治療的靶點。本研究初步提示了miR-449b 在子宮內膜腺癌HEC-1 -B 細胞中的生物學功能和分子調控機制。而miR -449b 還通過哪些其他分子機制作用于子宮內膜腺癌中還有待于進一步研究。

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