三黃瀉心湯水提物對痤瘡丙酸桿菌體外抑制實驗

陳芳園，閔仲生

(1.南京中醫藥大學，南京210029;2.江蘇省中醫院，南京210029)

痤瘡是一種臨床常見好發于毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，各年齡皆可發病，青少年時期發病率最高。近年來由于飲食結構及環境等改變，發病率有上升趨勢，由于病程較長，嚴重者可發展成結節、囊腫以及聚合性痤瘡，愈后容易留下痘印凹坑，嚴重影響美觀，造成患者的心理壓力。三黃瀉心湯出自張仲景《金匱要略》［1］“大黃2兩，黃連1兩，黃芩1兩，以水3升，煮取1升，頓服之”。方中大黃為主藥，黃連、黃芩為輔藥。本實驗采用不同濃度三黃瀉心湯水提物，觀察在體外對痤瘡丙酸桿菌生長的抑制情況。報告如下。

1 材料

1.1 菌株 痤瘡丙酸桿菌凍干菌株標準菌株(ATCC11827，購自廣東省微生物研究所)。

1.2 試藥 注射用乳糖酸紅霉素粉針(購自湖南科倫制藥有限公司，批號:1310202B);三黃瀉心湯(由江蘇省中醫院藥劑科配置提供)。厭氧指示劑、厭氧產氣袋(選自日本三菱瓦斯株式會社);瓊脂(L3027，購自美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3 儀器 恒溫生化培養箱(選自上海躍進醫療器械有限公司);數顯氣浴恒溫振蕩器(常州賽普實驗儀器廠);立式壓力蒸汽滅菌器(選自博訊實業有限公司醫療設備廠);WGZ-1A濁度計(上海昕瑞儀表有限公司);BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器［北京］有限公司);7.0 L厭氧盒(三菱瓦斯化學株式會社)。

2 方法與結果

2.1 痤瘡丙酸桿菌的復蘇以及菌懸液的制備 瓊脂培養基115℃高壓滅菌15 min澆板，作為凍干菌株復蘇平板。微生物限度室內，將全部菌體懸液，移植于瓊脂培養基，平推后置于厭氧培養盒內，37℃厭氧培養48 h，挑取單個生長菌落至肉湯培養基。

2.2 菌落計數 提取已經配備好的菌懸液1 mL，加到9 mL裝有生理鹽水的試管中，就可以得到稀釋10倍的菌液。從稀釋10倍的菌懸液中移取1 mL至9 mL生理鹽水中，從而得到稀釋100倍的菌液。以此類推，依次稀釋，直至得到稀釋1 010倍的菌液，從中各移取0.5，1 mL到平板培養基上，均勻涂布，37℃厭氧培養48 h，然后對生長的菌落進行計數，作出細菌的生長標準曲線。調整細菌濃度至106，待用。

2.3 中藥藥液稀釋 采用試管稀釋法。三黃瀉心湯煎劑調整至相當于生藥濃度200 mg/mL，取11支滅菌試管加入營養肉湯1.0 mL，移取三黃瀉心湯煎劑1 mL，加入第1管中，充分混和均勻后取1 mL，加入第2管，以此類推，到第10根試管時從中取1 mL棄去，最后一根試管中不加任何藥物，只作為培養基對照組，稀釋濃度和相應藥物含量見表1。

表1 三黃瀉心湯水提物藥物稀釋度和相應藥物含量

2.4 羅紅霉素藥液稀釋 采用試管稀釋法。將乳糖酸紅霉素調整濃度至200 mg/mL，取11支滅菌試管加入營養肉湯1.0 mL，將配備好的乳糖酸紅霉素1 mL，加入到第1根試管中，充分混勻混合后取1 mL，再移入第2根試管，以此類推，第10根試管取1 mL棄去，最后一根試管為培養基對照組，稀釋濃度和相應藥物含量見表2。

2.5 藥敏試驗 用100 μL定量加樣槍于每管中加入上述新鮮配置菌液100 μL，搖勻，加2～3 mL液體石蠟，置于37℃恒溫振蕩器中培養48 h，觀察結果。

表2 乳糖酸紅霉素藥物稀釋度和相應藥物含量

2.6 結果判定 由于中藥的顏色都較深，所以光是靠肉眼無法判定試管中是否有細菌生成以及對藥物的敏感情況。因此在恒溫振蕩器培養48 h后，每管吸取0.5 mL混懸液接種，澆板，置于37℃恒溫、厭氧環境中培養48 h，將平板放置在無反光，暗色的物體表面上觀察各平板是否有菌落產生，這種方法可以排除中藥顏色深帶來的感染，可以直觀的觀察到實驗結果。在實驗過程中能夠完全抑制痤瘡皮膚桿菌的生長的藥物濃度，為對細菌的最低抑菌藥物濃度(MIC)，以上實驗步驟重復3次。

2.7 結果 空白對照試管中觀察有菌落生成，在革蘭氏染色鏡檢下可見紫色細小棒狀或桿狀菌，證明是革蘭氏陽性厭氧菌痤瘡丙酸桿菌，未見其他菌在視野中，沒有被污染［2］。三黃瀉心湯水提和乳糖酸紅霉素對痤瘡丙酸桿菌的MIC，見表3。結果表明三黃瀉心湯在濃度低至6.25 mg/mL時，平板可見痤瘡丙酸桿菌菌落，高于此濃度時，均未見痤瘡丙酸桿菌菌落，說明三黃瀉心湯及其主要成分大黃、黃芩、黃連對痤瘡的主要致病菌痤瘡丙酸桿菌有較好的抑制作用，乳糖酸紅霉素培養平板中均未見痤瘡丙酸桿菌的菌落。

表3 三黃瀉心湯和乳糖酸紅霉素對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用

3 討論

現代醫學認為，痤瘡的發病機制主要與皮脂分泌過多、毛周角化過度、痤瘡丙酸桿菌繁殖以及炎癥反應四種因素相關［3］，而毛囊皮脂腺中的痤瘡丙酸桿菌大量繁殖是痤瘡發病的重要因素［4］。有學者［5］認為痤瘡的嚴重程度與皮脂腺的分泌量有關，皮脂分泌過多則痤瘡丙酸桿菌的養料就越多。痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)［6］是定居在人體皮膚和黏膜中的正常菌群，屬于小桿菌，它的生長是通過皮脂中的三酰甘油作為養料，并且皮脂中去脂化的脂肪酸含量與細菌的數量成正比。同時痤瘡丙酸桿菌產生的大量胞外酶，痤瘡丙酸桿菌介導的細胞免疫這些都增強了痤瘡的炎癥反應，是引發痤瘡炎性反應的主要原因［7］。

一般在中重度的痤瘡的治療中，都會考慮結合抗生素的治療，而最常用的抗生素有大環內酯類、四環素類或克林霉素等。紅霉素是大環內酯類代表性抗生素，對痤瘡丙酸桿菌有很強的抑制作用，但是Eady等［8］研究表明痤瘡患者中痤瘡丙酸桿菌耐藥性的發生率在逐年上升，紅霉素的耐藥性最為多見，四環素耐藥其次。有報道［9］認為丙酸桿菌對紅霉素產生耐藥是因為紅霉素A、B、C基因保護這些新合成的核糖體免受大環內酯類藥物的影響，并且紅霉素還存在交叉耐藥，導致藥物療效更差。

傳統中醫認為痤瘡的發病是由肺熱、血熱、風熱三要素所引起，而現代醫家在原來的基礎之上又提出了血瘀、濕熱等新看法［10］。三黃瀉心湯具有瀉火解毒，燥濕泄熱的作用，是治療外科瘡瘍的常用方，瀉火劑中的代表性方劑［11］。大黃、黃連、黃芩泄三焦之火，因此在臨床應用中三焦實火或無形熱邪內迫都可用三黃瀉心湯治療，所以有很多醫家用于治療痤瘡。如喬成林［12］用本方加減治療痤瘡;國內研制［13］的純中藥制劑一清膠囊也是原方出自《金匱要略》中的瀉心湯，一清膠囊中大黃、黃連、黃芩相互配伍，常用于治療熱毒血盛之身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉、牙齦腫痛，大便秘結等癥，具有涼血止血、清熱瀉火之功效［14］，還有報道［15］其臨床應用廣泛，除能有效治療痤瘡外，還用于咽喉炎、丹毒、高血壓、上呼吸道感染等多種疾病。

大黃主要是含蒽醌類衍生物和二蒽酮衍生物［16］，具有顯著抑制巨噬細胞分泌細胞因子的功能，大黃中的游離蒽醌對痤瘡丙酸有很強的抑制作用，同時還對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌等多種細菌、真菌都有一定的抑制作用［17］;黃芩的主要化學成分是黃酮類，具有抗菌、消炎、抗氧化、神經系統保護等多種作用，具有廣譜抗菌的活性［18］;黃連含有多種生物堿，最主要的是小檗堿(黃連素)，其次是黃連堿，藥根堿等，抗菌譜廣，對于多種致病菌都有很好的抑制作用(如金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、淋球菌及白色念珠菌等真菌)［19］?，F代實驗研究［20-21］發現，大黃、黃芩等中藥在體外較低濃度時即能抑制痤瘡丙酸桿菌的生長，表現出良好的抗菌效果。三黃瀉心湯中3種主要成分是大黃酸、小檗堿、黃芩苷，為實驗采用三黃瀉心湯水提物進行痤瘡丙酸桿菌體外抑菌實驗提供了理論依據。

本實驗以三黃瀉心湯水提物為試藥，乳糖酸紅霉素標準品為參照物，對痤瘡丙酸桿菌進行體外抑菌實驗。實驗結果三黃瀉心湯水提物對痤瘡丙酸桿菌的MIC是6.25 mg/mL，表明其對痤瘡丙酸桿菌的生長有非常好的抑制作用。有研究［22］發現中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌有明顯抑制和殺菌作用，并且產生耐藥性的可能性極低。三黃瀉心湯作為單純的中藥復方制劑，對細菌不容易產生耐藥性，并且毒副作用更小。此實驗為三黃瀉心湯的進一步在臨床上的應用提供了科學的藥效學理論依據。

［1］張薛光.談談對《金匱要略》瀉心湯出處、方名的理解［J］.中醫文獻雜志，2007，25(3):9-12.

［2］吳小紅，劉瓦利，于勇.中藥蛇丹方及其構成生藥對痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用［J］.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2003，2(4):222-224.

［3］LAYTON A M.Optimal management of acne to prevent scarring and psychological sequelae［J］.American journal of clinical dermatology，2001，2(3):135-141.

［4］尹興平，夏隆慶.痤瘡患者痤瘡丙酸桿菌耐藥性的研究進展［J］.國外醫學(皮膚性病學分冊)，2004，30(3):152-154.

［5］宋暢.痤瘡丙酸桿菌與手術后感染并發癥［J］.國外醫學(外科學分冊)，2000，27(6):322-324.

［6］BERSON D S，CHALKER D K，HAPRER J C，et al.Current concepts in the treatment of acne:report from a clinical roundtable［J］.Cutis，2003，72(1 Suppl):5-13.

［7］陳昭，王建美，高順強.痤瘡病因研究進展［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2005，8(2):107-108.

［8］EADY E A.Bacterial resistance in acne［J］.Dermatology，1998，196(1):59-66.

［9］WESTH H，HOUGAARD D M，VUUST J，et al.Prevalence of erm gene classes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated between 1959 and 1988［J］.Antimicrobial agents and chemotherapy，1995，39(2):369-373.

［10］周佳，陳力.中醫藥辨證治療痤瘡經驗［J］.吉林中醫藥，2008，28(4):261-262.

［11］宮慶東，張沁園，王洪海.大黃黃連瀉心湯歷史源流及古今應用［J］.山東中醫藥大學學報，2014(1):5-7.

［12］喬成林.瀉心湯加味治療痤瘡50例［J］.陜西中醫，1989(6):255.

［13］蔣獻，何燕，李利.一清膠囊對痤瘡丙酸桿菌及表皮葡萄球菌的體外抑菌作用研究［J］.中國藥房，2009，20(33):2573-2574.

［14］中華人民共和國藥典委員會.中國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:401.

［15］薛志平，劉杰，康文藝.一清膠囊臨床應用概況［J］.中成藥，2013，35(3):604-606.

［16］張偉.大黃不同炮制品的功效研究與應用［J］.長春中醫藥大學學報，2010，26(6):964-965.

［17］劉旭海.大黃藥理作用及臨床應用研究進展［J］.山東醫學高等?？茖W校學報，2007，29(3):229-231.

［18］戰渤玉，高明，李東霞，等.中藥材黃芩的研究進展［J］.中醫藥信息，2008，25(6):16-20.

［19］余園媛，王伯初，彭亮，等.黃連的藥理研究進展［J］.重慶大學學報:自然科學版，2006，29(2):107-111.

［20］朱亞芳，趙浩如.中藥體外抑制痤瘡丙酸桿菌的活性測定［J］.藥學與臨床研究，2009，17(3):224-226.

［21］李奕，許旭.三黃瀉心湯主要藥效成分的含量表征［J］.中國中藥雜志，2006，31(5):383-385.

［22］NAM C，KIM S，SIM Y，et al.Anti-acne effects of Oriental herb extracts:a novel screening method to select anti-acne agents［J］.Skin Pharmacology and Physiology，2003，16(2):84-90.