長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌組織中的表達及其效應分析

滕衛軍 鄭曉娟 華宏軍 林峰

長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌組織中的表達及其效應分析

滕衛軍 鄭曉娟 華宏軍 林峰

目的鉬分析胃癌組織特征長鏈非編碼RNA（lncRNA）表達譜，并探討長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌中的表達及效應。方法鉬采用基因芯片檢測6例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織LncRNA表達水平，分析胃癌組織特征lncRNA表達譜，進一步通過定量PCR檢測40例胃癌及其對應的癌旁正常組織中UCA1的表達并分析淋巴結轉移、腫塊大小、細胞分化程度及病理分期等臨床病理特征的關系。在此基礎上，利用siRNA下調AGS胃癌細胞內UCA1表達水平，利用CCK-8試劑盒檢測UCA1干預對胃癌細胞增殖能力的影響。結果 LncRNA基因芯片檢測到胃癌組織1 021條差異＞2倍的lncRNA（P＜0.05），定量PCR驗證明顯差異表達的UCA1在胃癌組織中的表達顯著高于正常組織（P＜0.01）。此外，臨床病理相關分析顯示，UCA1表達水平還與胃癌的細胞分化程度及病理分期相關。分化低的胃癌組織中UCA1表達水平明顯高于中、高分化的胃癌組織（P＜0.05）；病理分期Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的標本（P＜0.05）。此外，下調UCA1胃癌細胞表達可明顯抑制細胞增殖。結論 異常表達的lncRNA參與了胃癌的發生、發展，其中腫瘤組織上調表達的UCA1是胃癌重要的促癌基因。

胃癌 長鏈非編碼RNA 細胞增殖

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病機制尚未完全闡明。從分子水平闡明胃癌發生、發展機制，將為尋求新的胃癌標記物及有效的生物治療靶點提供新的思路。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上調控基因的表達水平[1-4]。lncRNA在轉錄水平、轉錄后水平以及表觀遺傳等多個層面參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程[1-4]。近年來人們開始關注lncRNA在各種生物學過程以及疾病中所起到的作用，尤其是癌癥[5-6]。有研究表明lncRNA與腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及復發高度相關[7]，但目前關于lncRNA在胃癌中的研究尚停留在起步階段?，F我們采用lncRNA基因芯片檢測胃癌組織及癌旁正常組織lncRNA的表達水平，篩選胃癌組織特征lncRNA表達譜，在此基礎上選擇胃癌組織上調最明顯的UCA1（LINC00178），通過定量PCR進行驗證，并通過體外干預實驗，分析其對胃癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗標本 40例胃癌組織及配對癌旁正常組織標本來自2008-2012年在兩家醫院行手術治療的胃癌患者?；颊咝g前均未行放、化療，年齡42～80歲，中位年齡65歲；組織病理類型的判斷參照WHO胃癌的病理學分類標準，TNM分期參照UICC/AJCC 2002年標準。每例標本留取腫瘤組織及對應的距腫瘤5cm以上的癌旁正常胃黏膜組織（經組織病理切片檢測證實），離體后10min內置于液氮中保存待做后續分析。

1.2 材料和試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；DNase I、RNase-free試劑購自美國Thermo公司；ReverTra AceRqPCR RT Kit、SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix等購自日本Toyobo公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自日本同仁研究所；人胃癌AGS細胞購自中科院上海細胞庫；Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片購自上?？党缮锛夹g有限公司；LncRNAsiRNA和Negative Control由上海吉瑪公司合成；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA的提取 取液氮保存的胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I說明書步驟進一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA溶液OD260/OD280，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.2 胃癌組織lncRNA表達譜檢測 抽提6例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織的RNA，根據Arraystar Human lncRNA Microarray V3.0芯片檢測的說明書，檢測30 586條lncRNA的表達，選擇差異倍數＞2，P＜0.05的lncRNA，采用非監督等級聚類方法分析胃癌組織特征lncRNA表達譜。

1.3.3 lncRNA UCA1表達分析 以GAPDH作為內參，分析UCA1表達。相關分析的引物序列見表1。2μg總RNA按照ReverTraAcerTqPCR RT Kit說明書進行逆轉錄。以20μl反應體系進行real-time PCR。定量PCR檢測反應體系包括：1μl RT產物，1×SYBR Green IMaster mix，10μmol/L特異前向引物、10μmol/L特異反向引物。real-time PCR條件為：95℃ 5min后，94℃ 15s，60℃1min，72℃30s，40個循環。所有樣品做3復孔。realtime PCR使用Bio-Rad CFX96儀器進行。根據待測標本的Ct值，以GAPDH為內參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-ΔΔCt表示標本中CXCL14相對表達量，其中△△Ct=（CtUCA1-CtGAPDH）腫瘤-（CtUCA1-Ct－GAPDH）正常。

表1 定量PCR檢測相關引物序列

1.3.4 細胞增殖與活性檢測 AGS胃癌細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在CO2體積分數為5%，37℃條件下培養、傳代。每2～3d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。為分析UCA1干預對細胞增殖與活性的影響，我們進一步采用siRNA干預胃癌細胞UCA1表達，1×105細胞/100μl接種96孔板，以20、40、80nM等濃度的 UCA1siRNA，按照 Lipofectamine2000轉染試劑說明書轉染細胞，同時設未轉染空白對照及陰性對照。參照CCK-8試劑盒說明書，用酶標儀測定在450nm處的OD值，檢測細胞相對活性=實驗組OD值/空白對照組OD值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，測得計量資料采用中位數（四分位間距）表示，UCA1在胃癌及其配對癌旁組織表達水平比較采用配對的非參數Wilcoxon符號秩檢驗；胃癌組織UCA1相對表達水平與胃癌臨床病理指標之間的關系采用Mann-Whitney U檢驗（兩組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行分析。

2 結果

2.1 胃癌組織lncRNA表達譜分析 6例胃癌組織及其配對的癌旁正常組織30 586條lncRNA中，與癌旁正常組織相比，1 021條lncRNA在胃癌組織的表達差異倍數＞2（P＜0.05），其中611條lncRNA明顯上調，410條lncRNA明顯下調。上調和下調表達最明顯的10條lncRNA見表2。

表2 胃癌組織差異表達最明顯的lncRNA

2.2 UCA1表達水平在胃癌組織中表達的驗證及其與胃癌臨床病理特征的關系 在上述芯片篩選的胃癌組織特征lncRNA表達譜中，UCA1（LINC00178）上調表達最明顯，與癌旁正常對照比較，胃癌組織中表達上調達28.28倍。采用定量PCR分析對40例胃癌及其配對癌旁組織UCA1表達水平也進一步證實芯片篩選的結果（圖1），采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 UCA1在胃癌及其配對癌旁組織中的表達

進一步分析UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關系顯示，UCA1的表達水平在不同細胞分化程度及病理分期存在統計學差異,低分化胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于中高分化的標本（P＜0.05）；病理分期Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織的UCA1表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的水平（P＜0.05）。UCA1的表達水平和性別、年齡、腫塊位置、腫塊大小、腫塊侵襲深度及淋巴結轉移情況無關（均P＞0.05），見表3。

2.3 下調UCA1表達對胃癌細胞增殖的影響 見圖2。由圖2可見，與空白對照、陰性對照比較，20、40及80nM濃度的UCA1 siRNA干預實驗組細胞增殖均明顯受到抑制（均P＜0.05）。

3 討論

在后基因組時代，RNA組學研究逐漸成為熱點：基因組超過98%的轉錄產物為不編碼蛋白的非編碼RNA，lncRNA是一類轉錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，起初lncRNA被認為是基因組轉錄的“噪音”，近年越來越多的研究表明，lncRNA可在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控機體生理、病理過程而受到關注。lncRNA通常分為5類：即正義（Sense）、反義（Antisense）、雙向（Bidirectional）、基因內（Intronic）及基因間（Intergenic）lncRNA[8]。目前發現lncRNA與很多的臨床意義。

表3 UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關系

本研究利用lncRNA基因芯片檢測6例胃癌組織及其配對的癌旁正常組織lncRNA的表達水平，發現了1 021條在胃癌組織異常表達lncRNAs，其中lincRNABBOX1-2、CR594506及UCA1等lncRNA已被證實[18]。利用（http://www.ebiomed.org/ncFANs/or http://www.noncode.org/ncFANs/）提供的ncFANs（non-coding RNA Function Annotation Server）網絡界面分析也顯示，多條lncRNA也與腫瘤發生密切相關[19-20]。定量PCR分析也進一步驗證了上調最明顯的UCA1（LINC00178）長鏈非編碼腫瘤的發生、發展密切相關，已成為腫瘤研究的新方向[8-9]。

圖2 UCA1siRNA干預對AGS胃癌細胞細胞增殖的影響（A：siRNA干預胃癌細胞對UCA1表達影響；B：UCA1 siRNA干預對AGS胃癌細胞增殖的影響。與空白對照及陰性對照比較，*P＜0.05）

近年來的研究表明，lncRNA在腫瘤中非常敏感，是腫瘤特異標記物，同時，lncRNA也可以作為腫瘤治療的分子靶點[10-12]。例如，lncRNA與結腸直腸癌的發生、發展密切相關，其可通過DNA甲基化、組蛋白修飾等多種途徑參與結腸直腸癌的發生、發展過程[13-14]。HULC已經被鑒定出在肝癌及腸癌肝轉移的組織中特異性高表達，是臨床肝癌的診斷和預后判斷的生物標記[10]。在原發乳腺癌腫瘤中HOTAIR表達增高，并且HOTAIR表達水平是原發乳腺癌腫瘤轉移和患者死亡的獨立的預后因素[11]。而且，siRNA干擾HOTAIR表達，能夠明顯抑制腫瘤侵襲和轉移，表明HOTAIR可以作為診斷和治療的重要靶點[11]。此外，lncRNA的表達與腫瘤的化療敏感性有關，沉默lncRAN表達能顯著增加順鉑或甲烯氧四環素誘導的細胞凋亡，從而增加化療敏感性[12]。但LncRNA與胃癌相關的研究尚為數不多。Cao等[15]利用GEO數據庫分析，發現胃癌組織71條上調、17條下調表達的lncRNA。Lin等[16]利用LncRNA芯片檢測也發現了胃癌組織2 621條差異表達的lncRNA。Song等[17]也發現了135個差異表達lncRNA，并探討了H19及uc001lsz RNA，提示其和胃癌的發生、發展有密切的關系。

UCA1屬于基因間lncRNA，長度2 314bp，定位于19號染色體p13.12區域。已經證實，UCA1上調表達可影響大腸癌細胞增殖、凋亡和細胞周期分布[21]，并與黑色素瘤的轉移相關[22]。最近Li等[23]也發現，食管鱗狀細胞癌UCA1過表達與預后不良相關。本研究分析UCA1表達水平與胃癌臨床病理特征的關系顯示，UCA1的表達水平與細胞分化程度及病理分期相關，而且，下調UCA1胃癌細胞表達可明顯抑制細胞增殖，進一步提示UCA1也是胃癌重要的促癌基因。已經證實，UCA1可通過mTOR-STAT3/microRNA143途徑上調己糖激酶2（hexokinase 2）促進腫瘤細胞糖代謝[24]，并可通過抑制p27（Kip1）表達促進乳腺腫瘤生長[25]。此外，UCA1還可通過CREB及PI3-K依賴的途徑調控膀胱癌細胞周期分布[26]。UCA1在胃癌發生、發展中的機制有待于進一步研究。

[1]Gong C,Maquat L E.lncRNAs transactivate STAU1-mediated m RNA decay by dup lexing with 3'UTRs via Alu elements[J].Nature,2011,470(7333):284-288.

[2]Mercer TR,DingerM E,Mattick JS.Long non-coding RNAs:insights into functions[J].Nature reviews Genetics,2009,10(3): 155-159.

[3]Wang K C,Chang H Y.Molecu larmechanisms of long noncod ing RNAs[J].Molecularce ll,2011,43(6):904-914.

[4]Wilusz JE,Sunwoo H,Spector D L.Long noncod ing RNAs:functional surp rises from the RNA world[J].Genes&development, 2009,23(13):1494-1504.

[5]Silva J M,Perez D S,Pritchett J R,et al.Identification of long stress-induced non-cod ing transcrip ts that have altered exp ression in cancer[J].Genom ics,2010,95(6):355-362.

[6]Huarte M,Rinn J L.Large non-cod ing RNAs:m issing links in cancer?[J].Hum anmoleculargenetics,2010,19(R2):R152-161.

[7]Tsai M C,Sp itale R C,Chang H Y.Long intergenic noncod ing RNAs:new links in cancer p rog ression[J].Cancer research,2011, 71(1):3-7.

[8]Ponting C P,O liver P L,Reik W.Evolution and functions of long noncod ing RNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.

[9]Harries LW.Long non-cod ing RNAs and hum an d isease[J].Biochem ica lSociety transactions,2012,40(4):902-906.

[10]Wang J,Liu X,Wu H,etal.CREB up-regulates long non-cod ing RNA,HULC exp ression through interaction with m icroRNA-372 in liver cancer[J].Nuc leic acids research,2010,38(16):5366-5383.

[11]Kogo R,Shimamura T,Mimori K,et al.Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor p rognosis in colorectalcancers [J].Cancer research,2011,71(20):6320-6326.

[12]Zhu Y,Yu M,LiZ,etal.identified long noncoding RNA,enhances human b ladder tumor grow th,invasion,and survival[J].Urology 2011,77(2):510-515.

[13]Yang F,Huo XS,Yuan SX,etal.Rep ression of the long noncoding RNA-LET by histone deacetylase 3 contributes to hypoxia-m ed iatedm etastasis[J].Mo lecularce ll,2013,49(6):1083-1096.

[14]QiP,Xu M D,NiS J,etal.Low exp ression o f LOC285194 is associated w ith poor p rognosis in colorectal cancer[J].Journalof translationalm ed icine,2013,11:122.

[15]CaoW J,Wu H L,He B S,etal.Analysis of long non-cod ing RNA exp ression p rofiles in gastric cancer[J].World journal of gastroenterology:WJG,2013,19(23):3658-3664.

[16]Lin X C,Zhu Y,Chen W B,et al.Integ rated analysis of long non-cod ing RNAs and m RNA exp ression p rofiles reveals the potentialro le o f lncRNAs in gastric cancer pathogenesis[J].International journalofoncology,2014,45(2):619-628.

[17]Song H,Sun W,Ye G,et al.Long non-cod ing RNA exp ression p rofile in human gastric cancer and its c linicalsignificances[J]. Journalof translationalmed icine,2013,11:225.

[18]GuW,Gao T,Sun Y,etal.LncRNA exp ression p rofile reveals the potential role of lncRNAs in gastric carcinogenesis[J].Cancer, 15(3):1-10.biomarkers:section A ofDiseasemarkers,2015,15 (3):1-10.

[19]Liao Q,Liu C,Yuan X,et al.Large-scale p rediction of long non-coding RNA functions in a coding-non-cod ing gene co-exp ression network[J].Nuc leic acids research,2011,39(9): 3864-3878.

[20]Liao Q,Xiao H,Bu D,etal.ncFANs:a web server for functional annotation of long non-coding RNAs[J].Nuc leic acids research,2011,39(Web Server issue):W118-124.

[21]Han Y,Yang YN,Yuan HH,etal.UCA1,a long non-coding RNA up-regulated in colorectal cancer in fluences cell p roliferation, apop tosis and cellcyc le d istribution[J].Patho logy,2014,46(5): 396-401.

[22]Tian Y,Zhang X,Hao Y,et al.Potential roles of abnormally exp ressed long noncod ing RNA UCA1 and Malat-1 in m etastasis o fme lanoma[J].Me lanoma research,2014,24(4):335-341.

[23]Li J Y,Ma X,Zhang C B.Overexp ression of long non-cod ing RNA UCA1 p red icts a poor p rognosis in patients w ith esophagealsquamous ce llcarcinoma[J].Internationa l journalof c linicaland experimentalpatho logy,2014,7(11):7938-7944.

[24]Li Z,Li X,Wu S,et a l.Long non-cod ing RNA UCA1 p rom otes g lycolysis by up regu lating hexokinase 2 through the m TOR-STAT3/m ic roRNA143 pathway[J].Cancer sc ience,2014, 105(8):951-955.

[25]Huang J,Zhou N,Watabe K,etal.Long non-cod ing RNA UCA1 p romotes b reast tumorg row th by supp ression ofp27(Kip1)[J]. Celldeath&d isease,2014,5:e1008.

[26]Yang C,LiX,Wang Y,etal.Long non-cod ing RNA UCA1 regulated cellcyc le d istribution via CREB through PI3-K dependent pathway in b laddercarcinoma cells[J].Gene 2012,496(1):8-16.

Expression of long non-coding RNA UCA1 in gastric carcinoma tissue

TENG Weijun,ZHENG Xiaojuan,HUA Hongjun,et al.De-partment of Gastroenterology,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the p rofiles of long non-cod ing RNA(lncRNA)exp ression in gastric cancer tissue.Methods The exp ression of lncRNAs was detected w ith m icroarray assay in 6 sam p les ofgastric tumor and matched adjacent tissues.The p rofiles of lncRNAs in gastric cancer tissues were identified.The UCA1 exp ression was evaluated by real-time reverse transcrip tion polymerase chain reaction(RT-PCR)in 40 gastric tumor sam p les and matched ad jacent tissues. The correlations of UCA1 exp ression w ith lym ph node metastasis,tumor size,celld ifferentiation,pathologicalstage were further analyzed.Tumor cellp roliferation was assessed follow ing siRNA knockdown of UCA1 by using the CCK 8 kits.Results A total of1 021 lncRNA exp ressed in gastric tumor sam p les＞2 folds thanmatched ad jacent tissues were identified(P＜0.05)using m icroarray assay.RT-PCR showed that the exp ression of UCA1 was significantly highly in gastric cancer than that in ad jacent tissues(P＜0.0001).High UCA1 exp ression was associated w ith celldifferentiation and pathologicalstage ofgastric cancer.UCA1 exp ression in low-d ifferentiated gastric cancerwas significantly higher than that in w ith high-d ifferentiated cancer(P=0.031).In add ition,UCA1 level in stageⅢ/Ⅳgastric cancerwas significantly higher than thatw ith stage I/IIcancer(P=0.013).Furthermore, inhibition of UCA exp ression supp ressed the p roliferation of gastric cancer cells.Conclusion Abnormalexp ression of LncRNA may be involved in the development of gastric cancer.Up-exp ression of UCA1 in tumor tissue m ight act as an oncogene and p romote the developmentofgastric cancer.

Gastric cancer Long non-cod ing RNA Cellp roliferation

2014-12-22）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技局重點課題項目(2012-3-006)；臺州市科技局項目（1301ky40）

321000金華市中心醫院消化內科（滕衛軍、鄭曉娟、華宏軍）；臺州市第一人民醫院普外科（林峰）

林峰，E-mail：linfeng2316@sina.com