酪酸梭菌抗阿司匹林致小鼠胃潰瘍作用的初步研究

沈淑蓉 朱靜 張浩 曾靜靜 付瑤陽 王雅琪 王方巖

酪酸梭菌抗阿司匹林致小鼠胃潰瘍作用的初步研究

沈淑蓉 朱靜 張浩 曾靜靜 付瑤陽 王雅琪 王方巖

目的鉬觀測酪酸梭菌是否對阿司匹林導致的胃潰瘍具有預防效應，并對其機制進行初步探討。方法鉬取30只健康雄性ICR小鼠，隨機分成3組，每組各10只，即模型組、酪酸梭菌組、奧美拉唑組。酪酸梭菌組以6×108c fu/只的菌量，模型組和奧美拉唑組均予以相同體積的無菌培養基，灌胃4d后再饑餓處理48h，然后以250mg/kg劑量的阿司匹林灌胃造模，奧美拉唑組小鼠于造模前30m in，腹腔注射奧美拉唑（13mg/kg）。造模4h后，取胃組織分別測定SOD、CAT活力、MDA含量；進行常規HE染色觀察胃黏膜組織結構變化，PAS染色判斷黏液量的變化，免疫組化法測定Bc l-2、Bax表達水平。結果 模型組的SOD、CAT活性明顯降低，MDA含量顯著增加，而酪酸梭菌預處理后逆轉了該趨勢（P＜0.01），與奧美拉唑組比較無統計學差異。HE染色觀察，酪酸梭菌能減輕胃黏膜的病理損傷，與奧美拉唑組無統計學差異。PAS結果提示酪酸梭菌能夠增加黏液量。酪酸梭菌組的Bc l-2表達較模型組顯著增多，同時Bax表達顯著減少。結論 酪酸梭菌預處理通過抗氧化應激、增加胃黏液量、上調Bc l-2/Bax表達比例，減輕阿司匹林造成的胃潰瘍損傷。

酪酸梭菌 阿司匹林 胃潰瘍 氧化應激

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是最為常見的胃部疾病，其發病率高，在造成胃黏膜損傷的諸多原因中，以非甾體抗炎藥物（non-steroidalanti-inflammatory drug，NSAID）的廣泛應用最為突出[1-3]，其中阿司匹林對胃黏膜的直接損害作用最為顯著。如何防治該類GU的發生與復發，仍是廣大研究人員所面對的重大課題。酪酸梭菌（Clostridium butyricum，C.butyricum）是專性厭氧的革蘭陽性芽胞桿菌，1933年由日本宮入近治博士首次發現。其形態呈直桿狀或稍有彎曲，中間輕度膨隆，兩端鈍圓，是一種存在于人和畜禽腸黏膜內的益生菌。其在人體腸道內可促進多種有益菌群的增殖，抑制有害菌和腐敗菌的生長、繁殖，改善腸道內的微生態環境，減少腸毒素的產生。在臨床應用中，酪酸梭菌治療腸道菌群紊亂引起的腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，取得了顯著療效[4-6]。在胃部疾病的治療中，酪酸梭菌已被用于拮抗幽門螺桿菌，且效果頗佳，但該菌對胃黏膜是否具有直接的保護作用，仍未有探討。本實驗旨在探索酪酸梭菌能否預防阿司匹林導致的GU，希望由此改善阿司匹林的不良反應，并且對酪酸梭菌在GU直接防治方面，提供更有力的支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗室保藏酪酸梭菌株（CGMCC NO. 8808）

1.1.2 液體培養基（TPY培養基） 水解酪蛋白10g/L，植物胨5.0g/L，酵母粉2.0g/L，葡萄糖5.0g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，氯化鎂0.5g/L，硫酸鋅0.25g/ L，氯化鈣0.15g/L，氯化鐵0.0001g/L，吐溫80 1.0g/L，pH 6.5±0.1。

1.1.3 試劑 注射用奧美拉唑鈉（江蘇奧賽康藥業股份有限公司），BCA蛋白定量試劑盒丙二醛（MDA）測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），PAS染色試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），阿司匹林（美國Sigma公司），Bcl-2多克隆抗體（美國Biovision公司），Bax多克隆抗體（美國Cell signal公司），免疫組化試劑盒（北京中杉公司）。

1.1.4 動物 ICR小鼠30只，雄性，體重（25.0±2.0）g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，按隨機數字表法分成3組，每組各10只。

1.2 方法

1.2.1 酪酸梭菌活化與傳代 取酪酸梭菌活化后將培養基置于37℃厭氧培養箱中培養20h，菌的濃度達2× 109cfu/ml。

1.2.2 造模 酪酸梭菌組灌胃0.3ml酪酸梭菌培養液/只；模型組和奧美拉唑組均灌胃相同體積的無菌培養基，處理4d后饑餓48h，以250mg/kg劑量的阿司匹林灌胃造模[7]。奧美拉唑組造模前30min腹腔注射奧美拉唑13mg/kg。

1.2.3 胃組織獲取 將小鼠頸椎脫臼處死，分別結扎賁門，幽門端后取胃，每組4只鼠胃置于10%甲醛中固定15min，沿胃大彎剪開，0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干水分，拍照。保存至甲醛溶液中，用于后期組織切片與染色觀察；剩余胃組織（每組6只）用冰0.9%氯化鈉溶液洗凈，存于-80℃冰箱，用于后續SOD、CAT、MDA指標測定。

1.2.4 潰瘍面積測定 將上述固定胃組織展開平置用掃描儀掃描，通過軟件Image-Pro Plus（IPP）6.0測量胃組織的總面積及出血潰瘍面，并計算兩者的相對面積比例。

1.2.5 HE染色 將固定后的胃組織進行常規脫水石蠟包埋，制成病理切片，切片厚度約為5μm，HE染色在光鏡下觀察胃黏膜的組織學變化。

1.2.6 PAS染色 將石蠟包埋的胃組織標本切片后，行常規PAS染色，在光鏡下觀察胃黏膜的黏液變化情況。

1.2.7 氧化還原指標測定 取出凍存胃組織稱重，用冰0.9%氯化鈉溶液制成10%胃組織勻漿，4℃2 500r/min× 10min，離心取上清液，采用雙縮脲蛋白質定量（BCA）法進行蛋白定量，檢測并計算以下各氧化還原指標單位含量。（1）SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧自由基，后者氧化羥氨形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，顯色后于550nm處有最大吸收峰[以吸光度（A）表示]。具體操作按試劑盒說明書進行。（2）CAT活力測定采用H2O2法：過氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生淡黃色的絡合物，在405nm處測定生成量，可以利用對照管和測定管的A值差異即可求出每毫克蛋白CAT活力（U/mgprot）。具體操作按試劑盒說明書進行。（3）MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法：MDA與TBA縮合，生成紅棕色產物，在532 nm處有最大吸收峰。根據標準曲線計算獲得MDA的摩爾濃度（μmol/mgprot）。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.8 免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達 將組織切片常規脫蠟后，行枸櫞酸抗原修復。分別用Bcl-2（1∶80）、Bax（1∶200）一抗4℃孵育過夜，滴加二抗室溫2h后，DAB工作液顯色，在顯微鏡下觀察，當出現特異性顯色時用蒸餾水終止反應，蘇木素復染10s左右，PBS返藍。最后脫水、透明、中性樹脂封片。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，測得計量資料采用表示，方差齊性者采用LSD法分析，不齊者采用Tamhane’s T2分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 小鼠胃黏膜損傷情況 見圖1-2。

由圖1可見，模型組的胃黏膜表面出血明顯，呈彌散性。但經酪酸梭菌預防性處理后，黏膜損傷顯著減輕，與奧美拉唑的效果相似。

由圖2可見，經PPI軟件計算所得的潰瘍指數，也提示模型組黏膜潰瘍顯著，而酪酸梭菌與奧美拉唑預處理后潰瘍指數得到明顯改善（均P＜0.01）。

圖1 各組小鼠胃黏膜標本形態（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組）

圖2 各組胃黏膜潰瘍指數變化

2.2 小鼠胃黏膜HE染色光鏡觀察 見圖3。

圖3 各組小鼠胃黏膜HE染色病理圖（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組；×200）

由圖3可見，模型組胃黏膜嚴重缺損，局部壞死脫落，腺體破壞嚴重。酪酸梭菌組和奧美拉唑組胃黏膜組織較完整，腺體排列較整齊，有少量炎癥細胞浸潤。

2.3 小鼠胃黏膜PAS染色光鏡觀察 見圖4。

圖4 各組小鼠胃黏膜PAS染色病理圖（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組；×200）

由圖4可見，模型組胃黏膜黏液層明顯變薄。與模型組相比，酪酸梭菌組與奧美拉唑組黏液層顯著增厚，酪酸梭菌組PAS甚至略優于奧美拉唑組。

2.4 各組胃組織的SOD、CAT活性及MDA含量變化見表1。

表1 各組胃組織的SOD、CAT活性及MDA含量變化

由表1可見，阿司匹林處理后，胃組織內的SOD、CAT活性明顯降低，而MDA含量顯著升高，在酪酸梭菌預處理后，以上這些變化都得到明顯改善（均P＜0.01）。酪酸梭菌組的各項指標較奧美拉唑組無統計學差異。

2.5 胃組織Bcl-2、Bax表達情況 見圖5。

圖5 各組胃組織Bcl-2，Bax免疫組化（上排：Bcl-2，下排：Bax；A：模型組，B：酪酸梭菌組，C：奧美拉唑組，×200）

由圖5可見，模型組Bcl-2的表達呈陰性或弱陽性，Bax呈強陽性。酪酸梭菌處理后Bcl-2顯著升高、Bax明顯下降，而奧美拉唑組Bcl-2、Bax的表達基本都呈陰性或弱陽性。

3 討論

阿司匹林是臨床上廣泛應用的NSAID類藥物，常用于預防及治療風濕性關節炎和血栓性心血管病。隨著人口老齡化的加劇，此類疾病日益增多，阿司匹林的應用越來越廣泛，由其誘發的GU亦愈發常見。環氧合酶（COX）能夠促進胃黏液分泌，增強胃的屏障作用，而阿司匹林抑制了COX，從而削弱了胃黏膜的屏障功能，造成胃對損傷因素的易感性[8]。在此過程中，有炎癥因子的參與如IL-1β、TNF-α等[9]，活性氧族（reactive oxygen species，ROS）也是重要的損傷因素[10]。

阿司匹林復制的小鼠GU模型，與患者服用NSAID類藥物造成的GU，在發病機制及臨床表現方面都有高度的擬合性。該模型是研究NSAID造成GU的機制及篩選防治藥物的良好模型[11]。本研究中，我們也成功復制該模型，并發現明顯的病理損傷及氧化應激，這與以往的研究相一致[10]。

在本研究中，酪酸梭菌預處理后，能夠較明顯的緩解阿司匹林所造成GU。肉眼觀察及病理切片結果顯示，酪酸梭菌減輕了胃黏膜的損傷程度。阿司匹林造成的SOD、CAT含量活性降低以及MDA升高，經酪酸梭菌預處理后也得到明顯改善。該結果提示，酪酸梭菌可能通過減輕氧化應激實現對胃黏膜的保護作用。在非酒精性肝病的研究中，酪酸梭菌可減少由肝病引起的ROS產量，實現對肝臟的保護效應[12]。PAS染色的結果提示酪酸梭菌能夠促進胃黏液的產生，從而保護胃黏膜，這是臨床現行的GU治療措施所不具備的特性，在將來的研究中可以更深入的闡述其機制，為臨床應用提供理論基礎。免疫組化的結果提示酪酸梭菌具有上調Bcl-2/Bax比例的能力，提示該菌能夠由此發揮抗凋亡作用。

正常人胃液的pH值為1.5～2.0，胃液里的鹽酸可以殺死隨食物進入胃內的細菌[13]，因此鮮有細菌能在胃內定植。但酪酸梭菌具有較強的抗酸能力，有學者已發現該菌能夠在小鼠胃內定植[14]，本研究則發現該菌能從多層面多角度對胃黏膜實施的保護作用，該特點是其他益生菌很難企及的。酪酸梭菌的這種顯著效應可能與其代謝產物有關，已有多個中心證實該菌兩個主要代謝產物丁酸和氫氣均是較為有效的抗氧化物質，而且丁酸是典型的組蛋白去乙?；敢种苿?，能夠調節基因的表達，這很可能是酪酸梭菌改變Bcl-2/Bax比例的主要原因[15-16]。

該菌是臨床上常規使用的益生菌，廣泛用于治療腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，若在臨床研究中也能夠證實其對胃黏膜的直接保護效應，將是廣大NSAID服用者的福音。

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Clostridium butyricum prevents gastric ulcer induced by aspirin in mice

SHEN Shurong,ZHU Jing,ZHANG Hao,et al.Department of Oncology,Wenzhou Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effectof Clostridium butyricum(C.butyricum)in p revention ofgastric ulcer(GU) induced by asp irin in m ice.Methods Thirty ICRm ice were random ly d ivided intomodelg roup,bacteria g roup andomep razole g roup(n=10/g roup).After starvation for 48h,m ice were given orally w ith 250mg/kg asp irin to estab lish GU model.Mice in bacteria g roup were orally p retreated w ith C.butyricum 6×108c fu for 4d before starvation,while m ice in model g roup and omep razole g roupwere given the samevolume ofsterile culturemedium.Mice in omep razole g roup were intraperitoneally injec ted w ith 13mg/kg omep razole 30m in p riorto asp irin treatment.Modeling for 4 h,gastric tissue was to harvest formeasuring the ac tivity of SOD and CAT,the contentofMDA,Bc l-2 and Bax,HE staining and PAS staining were performed.Results In modelg roup,the activity of SOD,CAT were significantly reduced while the content of MDA was significantly increased.The activity of SOD,CAT were increased while the contentofMDA was reduced in bacteria g roup(P＜0.01),there was no significantd ifference between bacteria and omep razole g roup.The Bc l-2 exp ression increased and Bax exp ression reduced in bacteria g roup.PAS stainning showed that themucus secretion was increased in bacteria g roup and HE staining showed that themucosa injury was attenuated in bacteria gorup.Conclusion C.butyricum can effectively p rotect the gastricmucosa againstdamages caused by asp irin inm ice.

Clostrid ium butyricum Aspirin Gastric ulcer Oxidative stress

2014-12-18）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局項目（Y20130215，Y20110136）；浙江省新苗計劃項目（2014R 413032）

325000溫州市中西醫結合醫院腫瘤科（沈淑蓉）；溫州醫科大學檢驗醫學院、生命科學學院（朱靜、張浩、曾靜靜、付瑤陽、王雅琪）；溫州醫科大學基礎醫學院病生教研室，溫州市中山醫院內科（王方巖）

王方巖，E-mail：w zyxyw fy@126.com