共刺激分子在原發性膽汁淤積性肝硬化中的研究進展

季蓉，徐婷，吳敏

·綜述·

共刺激分子在原發性膽汁淤積性肝硬化中的研究進展

季蓉，徐婷，吳敏

原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種慢性漸進性自身免疫性肝病，特征是匯管區淋巴細胞浸潤和膽管上皮細胞的選擇性破壞［1-3］。90%～95% PBC 患者血清中都會出現高低度抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）陽性。PBC 病因不明，可能是環境、免疫紊亂、遺傳變異等多種因素共同作用的結果。研究表明PBC 的發生與 T 細胞的異?；罨嘘P。原始 T 細胞的活化不僅需要 TCR/CD3 復合物與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）I、II 類分子的相互作用和識別，還需要共刺激分子的共同參與。共刺激分子是指參與免疫反應的輔助分子，存在于 T、B 淋巴細胞、抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）表面。共刺激信號在免疫應答中起著極其重要的作用，是決定受到抗原刺激的 T 細胞有效激發、適度效應和適時終止的關鍵因素。PBC 的發病機制主要是自身反應性 T 細胞的過度免疫反應。因此，控制自身反應性 T 細胞的活化和效應功能成為PBC 重要的潛在治療靶點?，F就共刺激分子 CD28/B7、CTLA-4/B7、PD-1/PD-L1、PD-L2 在 PBC 的免疫發病機制和相關治療綜述如下。

1 CD28/B7 和 CTLA-4/B7

1.1 CD28、CTLA-4、B7-1、B7-2 的分子結構

CD28 是大小為 44 kD 的 I 跨膜糖蛋白，是由二硫鍵連接而成的二聚體，屬于免疫球蛋白超家族成員，所有的CD4+T 細胞和約 50% 的 CD8+T 細胞都可以被誘導表達CD28。T 細胞活化后其表達量迅速增加，并誘導其他共刺激分子的表達。細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）也是免疫球蛋白超家族成員，與 CD28 在基因序列上有 70% 的同源性。但 CTLA-4 的表達范圍較窄，僅表達于活化的 CD4+T、CD8+T 細胞上。CD28 和 CTLA-4 與 APC 表面的天然配體 B7-1 和 B7-2 是目前最重要的共刺激分子。B7-1 是大小為 44～60 kD 的免疫球蛋白超家族成員，有典型的 I 型膜蛋白特征。它主要以二聚體的形式表達于活化的 B 細胞、單核細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）、巨噬細胞和 T 細胞表面。B7-2 是大小為 75～115 kD 細胞表面糖蛋白，與 B7-1 在氨基酸序列上有 25% 的同源性，B7-2 多以單體的形式表達于靜止的單核細胞、活化的 B 細胞、單核細胞、DC、自然殺傷細胞，巨噬細胞和 T 細胞表面。CTLA-4、CD28 與 B7 均互為受體配體。雖然 CTLA-4 的表達量不到 CD28 的 3%，但 CTLA-4 與 B7 的結合力卻可以達到 CD28 與 B7 結合力的 20 倍。兩者在 T 細胞免疫應答中的作用完全相反，CTLA-4 主要誘導 T 細胞的活化和增殖，CD28 則主要起抑制 T 細胞免疫應答的作用。

1.2 CD28/B7 和 CTLA-4/B7 的生物學功能

1.2.1 CD28/B7 的生物學功能 CD28/B7 提供 T 細胞活化的正性調節信號，CD28/B7 分子通過各種途徑參與了T 細胞的反應：①加強 TCR/CD3 復合物與 APC 之間黏附和相互作用，誘導 T 細胞的活化和增殖；②誘導 IL-2、IFN-γ 等多種細胞因子表達及其 mRNA 的穩定，間接誘導細胞分裂周期抑制因子 p27 的降解和 G1-激酶的表達等，從而促進 T 細胞活化［4］；③促進 CTLA-4、ICOS、OX40、4-1BB 等共刺激分子的表達，從而促進T 細胞亞群的分化和增殖［5］；④阻止 T 細胞無反應并誘導短鏈細胞凋亡抑制蛋白（c-FLIPs）和抗凋亡蛋白 Bcl-xL、Bcl-2 等的產生，從而調節 Fas/fasL 介導 T 細胞的凋亡［5］。

1.2.2 CTLA-4/B7 的生物學功能 CTLA-4/B7 提供 T 細胞活化的負性信號。研究發現 CTLA-4 缺陷性小鼠中 T、B 淋巴細胞大量增殖，血清免疫球蛋白濃度增高，說明CTLA-4/B7 在抑制 T 細胞活化和維持免疫自穩狀態中具有重要作用［6-7］，在 T 細胞活化過程中，CTLA-4 的作用機制是：①CTLA-4 可以下調整個 T 細胞群的增殖和細胞因子合成，起到抑制免疫應答的作用［8］。②CTLA-4 可以與 B7分子結合，從而抑制吲哚胺 2、3-加氧酶（idoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），IDO 可以大量分解 T 細胞增殖分化所必需的氨基酸如色氨酸等，間接抑制了 T 細胞活化［9］。③CTLA-4 還通過調節 T 細胞來抑制免疫應答反應［10］。

1.3 CD28/B7 和 CTLA-4/B7 在 PBC 中的研究現況

1.3.1 CD28/B7 與 PBC PBC 血清中 AMA 可識別 2-氧酸脫氫酶復合體，特別是位于線粒體內膜的丙酮酸脫氫酶E2（PDC-E2）。PBC 的主要靶組織是肝內小膽管，可見膽管周圍漿細胞浸潤和膽管上皮細胞（biliary duct epithelial cells，BDEC）損傷和抗 PDC-E2 的 T 細胞在 BDEC 上異常表達。Kamihira 等［11］研究發現在 PBC 患者外周血和肝臟組織中可見抗 PDC-E2 的 CD4+CD28-T 細胞顯著增加。這些 CD28-T 細胞主要通過以下途徑影響 PBC 疾病的進展：①CD4+CD28-T 細胞可以使 Bcl-2 表達增高并抑制Bcl-2 的凋亡［12］。此外，它還可以表達具有細胞毒作用的穿孔素、顆粒酶 B［13］及分泌具有細胞殺傷作用的 IFN-γ［14-15］。②Isse 等［16］研究發現 PBC 患者小葉間 BDEC 中的CD4+CD28-T 細胞能克隆擴增自身反應性 T 細胞，最終導致 PBC 患者 BDEC 的損傷。

Tsuneyama 等［17］發現在 PBC 早期階段，膽管周圍幾乎所有浸潤性 T 細胞表面均表達 CD28 及 B7-2。通過 DC和壞死 BDEC 中的 B7-2 和T 細胞上的 CD28 的相互作用激活 Th 細胞，從而分泌特異性的細胞因子［18］。以上研究均證實 CD28/B7 共刺激信號途徑在 PBC 發病機制中具有重要意義。

1.3.2 CTLA-4/B7 與 PBC Li 等［19］發現 CTLA4 基因的 rs231775 的 G 等位基因和 rs231725 的 A 等位基因與 PBC 的危險度顯著相關，攜帶 rs3087243 的 A 等位基因患者比攜帶相同片段 G 等位基因的患者有著更好的生活質量。sCTLA-4 是 CTLA-4mRNA 選擇性剪接外顯子 3導致半胱氨酸殘基的缺失的一種水溶性單體蛋白［20-22］。在自身免疫性甲狀腺疾病、I 型糖尿病、SSc、SLE 和 MG 患者血清中檢測到高濃度的 sCTLA-4，sCTLA-4 被認為是自身免疫性疾病的新的標記物［23］。Saverino 等［24］發現在 AMA陽性的 PBC 患者血清中可以檢測到 sCTLA-4。由此，我們推測 CTLA 基因的缺失干擾了 CTLA-4 蛋白的表達和功能，從而阻止 T 細胞活化抑制信號的傳遞。

研究表明，CTLA-4Ig 能有效地抑制 CD8+T 細胞增殖活化并阻斷 CD28/B7 信號通路［25］。Tanaka 等［26］構建了一個小鼠 PBC 的模型，小鼠表達的 TGF-β 受體（dnTGF-βRII）可促進 CTLA-4Ig 的分泌，結果發現 CTLA-4Ig 可以阻止誘導成 PBC 的小鼠的肝臟炎癥反應和 T 細胞的活化。因此 CTLA-4Ig 有望成為 PBC 的新的治療手段。

2 PD-1/PD-L1、PD-L2

2.1 PD-1/PD-L1、PD-L2 的分子結構

PD-1（programmed death-1）是一個大小為 55 kD 的I 型跨膜糖蛋白，屬于 CD28 免疫球蛋白超家族新成員，它包含一個 IgV 結構域和一個含有 97 個氨基酸的胞質尾，其胞質尾包含一個免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和一個免疫受體酪氨酸轉化基序（ITSM）［27］。PD-1 主要表達在活化的 T 細胞、B細胞髓系細胞和胸腺細胞上［28］。PD-1 有 2 個配體 PD-L1 和 PD-L2，兩者均屬于 I 型跨膜糖蛋白，兩種配體有 40% 的氨基酸序列相同，且均有IgC 與 IgV 型結構域、跨膜區和一個短而保守的胞漿區尾部。PD-L1 除了在大多數淋巴細胞上表達，還可以廣泛地表達于非淋巴樣細胞如上皮細胞［29］、內皮細胞［30］和各種腫瘤細胞［31-32］上。相反，B7-DC 表達的限制在巨噬細胞和樹突狀細胞上［33］。PD-1/PD-L1、PD-L2 在介導負性共刺激信號，抑制自身反應性 T 細胞和維持免疫耐受中發揮重要作用，也成為腫瘤免疫、移植免疫和自身免疫的研究熱點［34-35］。

2.2 PD-1/PD-L1、L2 的生物學功能

PD-1 基因敲除的 C57BL/6PD-1/- 小鼠可出現狼瘡樣腎炎和關節炎［36］。而 PD-1 基因敲除的 BALB/cPD-1/- 小鼠可發展為擴張型心肌?。?7］。這些結果表明，PD-1 及其配體在調節免疫耐受性和自身免疫性發揮重要作用。PD1/PD-L1、PD-L2 通過多種途徑參與機體的免疫調節：①PD-1 分子的細胞內信號由 PI3K-Akt 通路主導［38］。PD-1 可以通過 ITIM和 ITSM 中的 α-氨基對羥丙酸殘基進行傳導磷酸化信號，它通過 Lyn 磷酸化使 BCR 與 PD-1 的 Fc 片段的交叉偶聯更為緊密。此外，磷酸化的 ITSM 還可以產生去磷酸化作用，它通過 SH2 區域募集 SHP-2。SHP-2 又可使BCR 近端信號分子 Iga/b、Syk 去磷酸化，從而減弱下游分子 PLCg2、PI3K、vav 和 ERK1/2 的激活，由此抑制了B 細胞的活化［39］。PD-1/PD-L1、PD-L2 抑制 T 細胞受體、Toll 樣受體及微生物表面的受體信號傳遞也是通過類似的通路。②PD-1/PD-L1、PD-L2 可以通過抑制自身反應性 T 細胞的活化和功能及促進 Foxp3+Treg 細胞的形成和功能，進而誘導機體的免疫耐受。③PD-L1 促進 TH2 型免疫應答及其細胞因子（IL-10 和 IL-4 等）的分泌，抑制 TH1 型免疫應答及其細胞因子（IL-2 和 IFN-γ 等）的分泌。④PD-1影響 T 細胞在胸腺發育過程進而影響外周 T 細胞庫［40］。

2.3 PD-1/PD-L1、PD-L2 與 PBC

PD-1 可以表達在肝臟的庫普弗細胞（Kupffer cells，KC）、其他單核細胞衍生的細胞、上皮細胞、內皮細胞及腫瘤細胞上［32，41-42］。Mataki 等［43］研究發現，PD-L1、PD-L2 可表達在肝臟的門脈區。PD-L1 主要表達在 KC、DC 及肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）上，尤其在 LSEC 上表達特別強烈，而 PD-L2 只出現在 KC 和DC 上。肝內 PD-1 和 KC 及 LSEC 上的 PD-L1、PD-L2相互作用可以下調自身反應性 T 淋巴細胞從而引起 PBC的免疫失調［44］。實驗中，他們還發現肝內表達的 PD-L1、PD-L2 受 IFN-γ 的調節，PBMCs 受到 IFN-γ 刺激后，PD-L1、PD-L2 的表達均會上升。因此我們可以通過調節IFN-γ 的分泌，從而達到控制 PD-L1、PD-L2 的表達及疾病進展的目的。

大量研究證實自身免疫性疾病的發生和發展與遺傳相關。Juran 等［45］研究發現 PD-1 的 PD1.3A 等位基因會促進本身攜帶 CTLA4 49AG：CT60 AA 單倍型基因且 AMA 陽性的 PBC 患者疾病進一步進展。因此對 PBC 患者進行遺傳性分析，我們就可以對 PBC進行早期診斷，病情評估以及選擇合理的治療方案。Chen 等［46］還發現 MSC 可以上調PD-L1 的表達從而抑制 IL-17 產生，這為我們治療自身免疫性肝病提供了新的思路。

3 展望

綜上所述，共刺激分子與 PBC 的發生、發展密切相關，但其機制仍有待深入研究，隨著分子生物學科學技術以及相關學科的不斷發展，科研與臨床疾病之間日益增加的聯系，我們還可能發現更多的共刺激分子，它們的分子結構、生物學功能以及與 PBC 之間的關系的研究將會有更大的進展，隨著對 PBC 發病機制的不斷深入研究，我們相信會為PBC 的診斷和治療提供全新的視角和前景。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.015

江蘇省常州市衛生局重大科技項目（ZD201108）；國家自然科學基金青年科學基金（K11245213）

213003 常州，蘇州大學附屬第三醫院風濕免疫科

吳敏，Email：wuumin@163.com

2015-06-08