葉酸代謝相關基因多態性在母胎醫學領域的應用及相關性研究

陳小梅，韓淑芬

(1.河北唐山市灤南婦幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市婦幼保健院，河北 唐山 063500)

【出生缺陷預防】

葉酸代謝相關基因多態性在母胎醫學領域的應用及相關性研究

陳小梅1，韓淑芬2

(1.河北唐山市灤南婦幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市婦幼保健院，河北 唐山 063500)

目的 探討葉酸代謝相關基因多態性在母胎醫學領域的應用及相關性研究。方法 該研究應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，研究葉酸代謝與唐氏綜合征(DS)、非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)之間的關系。結果 DS與葉酸代謝之間，經Logistic回歸分析，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風險是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風險增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)。NSCL/P與葉酸代謝之間，經Logistic回歸分析，攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風險提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)。結論 采用分子醫學檢測，在一定程度上能夠解釋葉酸利用能力障礙所導致的胚胎發育異常，但是也有一定的局限性。

葉酸代謝；唐氏綜合征；非綜合征性唇腭裂；母胎醫學

據調查研究表明，活產新生兒中有5%左右存在各種先天缺陷，而新生兒死亡約20%由先天畸形導致[1-2]。人類自身不能合成葉酸，必須依賴食物供給，葉酸(folic acid，FA)又稱蝶酰谷氨酸，是人體必不可少的營養物質，其主要生物學功能是作為甲基供體參與細胞內的甲基化反應和脫氧核糖核酸的合成，葉酸不能被人體直接利用，必需通過一系列活化才能發揮其生理功能。葉酸利用代謝異常是母嬰醫學中導致胚胎發育異常的環境因素之一，常見的胚胎發育異常有(neural tube defect，NTD)[3]、唐氏綜合征(down syndrome, DS)[4]、非綜合征性唇腭裂(non syndromic cleft lip and cleft palate，NSCL/P)[5]、先天性心臟病[6-7]等。本文主要探討葉酸代謝轉運過程中，利用分子醫學檢測的手段對葉酸代謝與DS、NSCL/P之間的關系研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象

DS研究：病例組為河北唐山市灤南婦幼保健院3年來就診治療的DS患者母親血樣80份；對照母親血樣83份，與病例母親生活環境相近，生育過孩子，無不良生育史，染色體核型正常。

NSCL/P研究：病例組為河北唐山市灤南婦幼保健院近3年來就診治療的NSCL/P患者77例，年齡12.14±8.79歲，男40例，女37例；對照組75例，年齡11.96±9.14歲，男38例，女37例，排除伴有其他畸形的綜合性唇腭裂以及其他器質性疾病。

本研究經倫理委員會批準，未違反醫學倫理學原則，所有患者均自愿加入本研究并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

本研究應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，對還原葉酸載體(reduced folate carrier1，RFC-1)和蛋氨酸合酶(methionine synthase，MTR)基因多態性進行檢測，探討葉酸利用能力相關基因MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G與DS的關系。

1.2.1 標本的收集

所有受試對象均與住院后次日清晨采血，均取肘靜脈血5mL置于真空EDTA-K2抗凝管中，以1 000r/min離心獲取血小板豐富的血漿，接著以1 800r/min離心7min從而獲取血小板貧瘠血漿。真空EDTA-K2抗凝管中，以1 500r/min離心獲取血小板豐富的血漿，接著以2 500r/min離心8min從而獲取血小板貧瘠血漿。

1.2.2 主要試劑及儀器

主要試劑：RNA提取物試劑盒購于美國ABI公司；反轉錄試劑盒購于美國LC Science公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生生物有限公司。儀器：臺式離心機(Eppendorf Mini spin，Beckman公司)、紫外交聯儀(BIO-RAD公司)、凝膠成像分析儀(美國ABI公司)以及定量PCR儀(uVP公司)。

1.2.3 實驗步驟

1.2.3.1 組織與血漿中RNA的提取 取500μL血小板貧瘠血漿置于1.5mLEP管中，加入20μL的Proteinase K消化液進行消化，然后按照Trizol LS試劑盒說明書進行后續操作，使用NanoDrop 1 000檢測血漿中總RNA的濃度。

1.2.3.2 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性反應 首先配置逆轉錄反應體系，即：無RNA酶雙蒸水14.75μL，0.5μLRNase抑制劑，1μL逆轉錄酶。將100ng總RNA、2μLRT引物以及5μLBuffer加入到上述反應體系中，在43℃50min中，95℃5min中進行逆轉錄反應。，再進行PCR反應：需要5μLcDNA、1μL上游引物以及下游引物、12.5μL 2×Master Mix，補充雙蒸水至25μL，95℃預變性5min中，95℃變性25s，50℃退火30s，70℃延伸40s，35個循環，72℃后延伸5min。RT引物以及PCR引物見表1。記錄各個反應管中的熒光信號所設立的閾值時循環數(CT值)，將原始數據取3次以上重復掃描后取平均值，以U6作為內參進行歸一，計算MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G相對表達情況，應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，對CBS和SHMTI基因上的兩個單核苷酸多態性(SNP)rs397589和rs1979276進行檢測。MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G凝膠圖像顯示見附圖。

表1 葉酸代謝相關基因以及U6的RT-PCR引物序列

Table 1 Folate metabolism-related genes and RT-PCR primer sequences of U6

1.3 統計學方法

所有數據分析采用SPSS 19.0軟件處理。應用擬合優度χ2檢驗，分析基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，確認樣本的群體代表性?；蛐鸵约盎蝾l率分布的比較采用Pearsonχ2檢驗。關聯分析用χ2檢驗和Logistic回歸分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 唐氏綜合征與葉酸利用能力的關系

2.1.1 等位基因頻率的分布

MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因頻率的分布經Hardy-Weinberg平衡檢驗病例組和對照組各基因型達到遺傳平衡(均P>0.05)，具有群體代表性。MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR等位基因頻率的差異均無統計學意義(χ2值分別為1.438、1.185、0.413、0.253，均P>0.05)，見表2。

2.1.2 MTHFR、MTRR、還原葉酸載體和蛋氨酸合酶各基因型與唐氏綜合征發生的關系

經Logistic回歸分析，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風險是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，而CT合并TT基因型未顯著增加DS發生的風險。以AA合并AG基因型為參照，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風險增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)，見表3。

表2 MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 2 Allele frequency distribution of MTHFR 677C>T, MTRR 66A>G, RFC-1 80G>A and MTR 2756A>G [n(%)]

附圖 凝膠圖像顯示檢測多態性PCR-RFLP圖譜

Fig. Gel image showing PCR-RFLP pattern of the examined polymorphism

表3 MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR多態性與DS關系的Logistic回歸分析

Table 3 Logistic regression analysis of the relationship between MTHFR, MTRR, RFC-1, MTR polymorphism and DS

2.2 非綜合征性唇腭裂與葉酸利用能力的關系

2.2.1 CBS和SHMT1基因上兩個SNP的等位基因頻率的分布

經Hardy-Weinberg平衡檢驗病例組和對照組各基因型達到遺傳平衡(P>0.05)，兩個SNP位點基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。兩個SNP位點基因頻率的差異均無統計學意義(χ2值分別為3.423、1.827，均P>0.05)，見表4。

表4 CBS和SHMT1基因兩個SNP的等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 4 Allele frequency distribution of two SNP on CBS and SHMT1 genes[n(%)]

2.2.2 CBS和SHMT1基因上兩個單核苷酸多態性的等位基因與非綜合征性唇腭裂發生的關系

經Logistic回歸分析，攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風險提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)，而GT和GG基因型未顯著增加NSCL/P發生的風險，見表5。

表5 CBS和SHMT1基因上兩個SNP的等位基因多態性與NSCL/P關系的Logistic回歸分析(n)

3 討論

3.1 葉酸代謝基因與唐氏綜合征的關系

本研究結果發現，在分子醫學檢測基因型模式下，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風險是CC基因型的2.41倍(P<0.05)，而CT合并TT基因型未顯著增加DS發生的風險。以AA合并AG基因型為參照，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風險增加2.74倍(P<0.05)。雖然引起DS發生的染色體不分離機制至今還不明確，但本研究顯示，葉酸代謝相關基因特別是MTHFR、MTRR突變與DS發生相關。還原葉酸載體-1(reduced folate carrier，RFC-1)幫助5-甲基四氫葉酸(methyltetrahydrofolate，5-MeTHF)進入細胞，RFC-1基因變異可引起葉酸轉運缺陷，進而可能導致與葉酸代謝有關的出生缺陷發病風險增加。結合本研究的發現，RFC-1 80G>A多態性單獨分析可能較少影響葉酸代謝，與DS的發生風險無顯著關聯，但不能排除其與其他葉酸代謝基因之間存在交互和修飾效應。

本研究結果發現，對CBS和SHMT1基因進行了trans-phase基因-基因相互作用分析，發現攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風險提高2.51倍(P<0.05)。說明在NSCL/P的發生中，這兩個基因的相互作用發揮關鍵的作用。如果這兩個代謝酶基因存在與疾病有關的相互作用，一方面會影響Hcy的轉硫代謝，造成Hcy在體內堆積，形成Hcy血癥[8]；另外一方面，會影響四氫葉酸的功能[9]，破壞DNA的正常甲基化和人類基因組的完整性，使得這種相互作用成為NSCL/P形成的潛在危險因素。

3.2 葉酸代謝基因的局限性

在母嬰醫學領域，采用分子醫學檢測手段，在一定程度上能夠解釋葉酸利用能力障礙所導致的胚胎發育異常，但是也有一定的局限性。由于葉酸代謝和蛋氨酸合成通路涉及的相關代謝酶和基因很多，還應該對多個相關基因同時進行基因變異篩查。本研究在母嬰醫學領域罕有報道，可以相信隨著分子醫學檢測水平的不斷提高，葉酸代謝障礙所導致的胚胎發育異常將不再是嚴重的社會問題。

[1]Kancherla V, Oakley G P,Brent R L. Urgent global opportunities to prevent birth defects [J].Semin Fetal Neonatal Med,2014,19(3):153-160.

[2]Bortolus R, Blom F, Filippini F,etal. Prevention of congenital malformations and other adverse pregnancy outcomes with 4.0 mg of folic acid:Community-based randomized clinical trial in Italy and the Netherlands[J].BMC Pregnancy Childbirth, 2014, 14:166.

[3]Wallis J. Folic acid use in preventing neural tube defects [J]. Midwives, 2011, 14(3):22

[4]Yang M, Gong T, Lin X,etal.Maternal gene polymorphisms involved in folate metabolism and the risk of having a Down syndrome offspring: A meta-analysis [J].Mutagenesis, 2013, 28(6):661-671.

[5] Bufalino A, Ribeiro Paranaíba L M, Nascimento de Aquino S,etal.Maternal polymorphisms in folic acid metabolic genes are associated with nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population[J].Defects Res A Clin Mol Teratol,2010,88(11):980-986.

[6]Sun L, Sun S, Li Y,etal.Potential biomarkers predicting risk of pulmonary hypertension in congenital heart disease: the role of homocysteine and hydrogen sulfide [J].Chin Med J,2014,127(5):893-899.

[7] Hobbs C A, Cleves M A, Macleod S L,etal. Conotruncal heart defects and common variants in maternal and fetal genes in folate, homocysteine, and transsulfuration pathways [J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2014, 100(2):116-126.

[8]Mládková J, Hladílková J, Diamond C E,etal. Specific potassium ion interactions facilitate homocysteine binding to betaine-homocysteine S-methyltransferase[J].Proteins, 2014, 82(10):2552-2564.

[9]王蘋，王紅，吳雅慧，等.中國人群葉酸/同型半胱氨酸代謝基因多態性與非綜合征型唇腭裂關聯研究[J].北京大學學報(醫學版), 2013, 45(3):352-358.

[專業責任編輯：于學文]

Application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine

CHEN Xiao-mei1, HAN Shu-fen2

(1.ChildHealthHospitalofLuannanofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China; 2.ChildHealthHospitalofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China)

Objective To investigate the application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to study the relationship between folate metabolism and Down’s syndrome (DS) as well as non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P).Results Logistic regression analysis showed that the risk of mothers carrying TT genotype of MTHFR gene was 3.62 times of that of the mothers carrying CC genotype in procreating children with DS (OR=2.41,95%CI:1.32-9.48,P<0.05), and the risk of mothers carrying GG genotype of MTRR gene increased by 2.74 times in procreating children with DS (OR=2.74,95%CI:1.23-8.38,P<0.05). Logistic regression analysis indicated that the risk of NSCL/P among mothers carrying rs397589 TT genotype of CBS gene enhanced 2.765 times (OR=2.51,95%CI:1.23-14.38,P<0.05).Conclusion Molecular medical examination means, to a certain extent, can explain the abnormal embryonic development caused by folic acid use disability, but there are some limitations.

folate metabolism; Down’s syndrome (DS); non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P); maternal-fetal medicine

2014-06-25

陳小梅(1974-)，女，主治醫師，主要從事婦產科臨床工作。

韓淑芬，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.048

R715.5

A

1673-5293(2015)01-0125-04