Beclin 1表達在胃癌發生和演進中的臨床病理意義及作用機制

鄭華川，申道福，楊雪峰，時帥，高陽，趙爽，張文陸

（遼寧醫學院附屬第一醫院腫瘤中心，遼寧省腦與脊髓損傷重點實驗室，實驗動物中心，遼寧 錦州 121001）

Beclin 1表達在胃癌發生和演進中的臨床病理意義及作用機制

鄭華川，申道福，楊雪峰，時帥，高陽，趙爽，張文陸

（遼寧醫學院附屬第一醫院腫瘤中心，遼寧省腦與脊髓損傷重點實驗室，實驗動物中心，遼寧 錦州 121001）

目的闡明胃癌發生和演進過程中Beclin 1表達的臨床病理意義和分子作用機制。方法胃癌細胞MKN28轉染Beclin 1表達質粒，利用CCK-8試劑盒和碘化丙啶染色檢測細胞增殖和周期。利用原位雜交和免疫組化檢測組織芯片上胃癌、癌旁黏膜和淋巴結轉移灶中Beclin 1mRNA和蛋白的表達，比較其與胃癌發生、臨床病理特征和預后的關系。結果Beclin 1過表達可以抑制胃癌細胞MKN28增殖并導致細胞周期G2期阻滯，胃癌中Beclin 1mRNA表達高于癌旁黏膜（P＜0.05），Beclin 1蛋白表達與胃癌遠處轉移呈負相關（P＜0.05），Beclin 1表達病例多見于老年男性（P＜0.05），彌漫型胃癌中Beclin 1表達低于腸型和混合型（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析顯示，Beclin 1表達與胃癌良好預后呈正相關（P＜0.05）。結論Beclin 1表達與胃癌發生、轉移和分化關系密切，可以作為胃癌患者的預后因素和基因治療的靶標。

胃癌；Beclin 1；疾病發生；演進；預后

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年發病率有所下降，但仍然嚴重威脅人類健康。分子遺傳學研究證明胃癌是異型性極高的惡性腫瘤，胃癌發生和發展是多階段、多基因和多因素參與的復雜過程，這些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA錯配修復基因等［1］。抑癌基因Beclin 1編碼蛋白含有Bcl-2同源結構域3（BH3）、卷曲螺旋結構域和進化保守結構域，可以與Vps34、UVRAG、Ambra1和抗凋亡蛋白形成復合體，進而誘導自噬發生且抑制凋亡［2］。Beclin 1等位基因缺失可引發胚胎致死，其雜合性可提高自發腫瘤發生率（如淋巴瘤、肝癌和肺癌），Beclin 1缺失細胞自噬水平降低、增殖水平升高，提示Beclin 1在抑制腫瘤發生方面具有重要作用［3］。本研究擬分析Beclin 1過表達對胃癌細胞增殖和細胞周期的影響，觀察胃癌發生和演進中Beclin 1 mRNA和蛋白的表達情況，比較其表達與胃癌臨床病理特征和預后的關系，為胃癌惡性生物學行為預警和基因治療提供分子靶標。

1 材料與方法

1.1 研究對象

于日本神奈川縣立癌中心附屬醫院收集胃癌（n=613）、鄰近正常黏膜（n=518，距癌≥4 cm）和淋巴結轉移灶（n=190）石蠟標本，其中女性186例，男性427例，年齡24～87歲，平均年齡62.1歲。伴有淋巴結轉移的患者265例，伴有肝轉移的患者35例。標本獲得符合神奈川縣立癌中心和遼寧醫學院倫理委員會要求，通過電話和病例查詢獲取胃癌患者的生存信息。臨床病理分期和組織分化分別依據UICC的TNM分期標準以及Lauren分型。部分侵襲、淋巴結轉移、組織Lauren分型和TNM臨床分期信息缺失。

1.2 細胞培養和轉染

胃癌細胞MKN28購自ATCC細胞庫，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，在37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞利用QIAGEN試劑盒轉染pcDNA3.1-Beclin 1表達質?；蛘遬cDNA3.1載體后G418處理并篩選單克隆。

1.3 細胞增殖檢測

使用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。于96孔板中每孔鋪2.0×103個細胞，待細胞貼壁后在不同時間點加入10 μL CCK-8溶液并培養3 h，最后于450 nm處檢測吸光度值。

1.4 細胞周期檢測

胰酶消化細胞，PBS漂洗，之后在10 mL冰乙醇中固定2 h以上，再經PBS漂洗后1 mL RNase（0.25 mg/mL）于37℃孵箱中消化60 min，待細胞沉淀后向混懸液中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI），使其終濃度為50 μg/mL，4℃下避光孵育30 min，最后經流式細胞儀檢測并分析實驗結果。

1.5 定量RT-PCR

利用Trizol試劑提取細胞總RNA，AMV酶反轉2 μg總RNA成cDNA，Beclin 1（F：5′-GATGGAAGG GTCTAAGACGTCCAA-3′，R：5′-TTTCGCCTGGGCT GTGGTAAG-3′）和內參GAPDH（F：5′-CAATGAC CCCTTCATTGACC-3′，R：5′-TGGAAGATGGTGAT GGG ATT-3′）引物依據GenBank序列進行設計，定量PCR操作依據SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進行操作。

1.6 Western blot

胃癌細胞在RIPA裂解液中超聲破碎，蛋白定量后變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印，使蛋白轉移至PVDF膜上，之后膜經5%脫脂奶粉封閉后用Beclin 1或者β-actin（美國Santa Cruz公司）一抗孵育60 min，室溫下用IgG-HRP二抗孵育60 min，孵育后均用TBST漂洗3次，每次5 min，最后ECL-Plus檢測試劑顯色并在LAS4010中獲取信號。

1.7 組織芯片制備

在HE指導下選取代表性組織結構部位，規格為2 mm的48陣列組織芯片利用組織芯片機（KIN-1，日本AZUMAYA公司）構建獲得，4 μm厚度切片備用。

1.8 原位雜交

以MKN28細胞cDNA為模板，利用PCR方法，采用地高辛－dUTP標記Beclin 1探針。組織切片經過脫蠟至水，20 μg/mL蛋白酶消化30 min，預雜交后42℃探針孵育過夜，切片經TBST漂洗后加上抗地高辛的堿性磷酸酶抗體孵育1 h，切片堿化后NBT/ BCIP顯色，甲基綠復染。Beclin 1 mRNA定位于細胞質中（圖2）。隨機選取5個視野并計數100個細胞，按如下標準分級：陰性（-），0%～5%；弱陽性（+），＞5%～25%；中度陽性（++），＞25%～50%；強陽性（+++），＞50%。

1.9 免疫組化

切片脫蠟至水，并將其放置于TRS抗原修復液中微波爐加熱修復15 min，之后用10%雙氧水封閉內源性的過氧化物酶，牛血清白蛋白第Ⅴ組份封閉非特異性著色?？雇肂eclin 1抗體（美國Sigma公司，1∶50）和抗兔HRP二抗分別孵育15 min，所有反應都在間歇照射微波爐中進行［1］，每次孵育后TBST漂洗，最后DAB顯色，Mayer’s蘇木素復染，脫水透明封片。去除一抗作為陰性對照。Beclin 1蛋白定位于細胞質中。隨機選取5個視野并計數100個細胞，按如下標準分級：陰性（-），0%～5%；弱陽性（+），＞5%～25%；中度陽性（++），＞25%～50%；強陽性（+++），＞50%。

1.10 統計學分析

應用SPSS 10.0統計軟件分析數據，采用t檢驗比較組間平均值，Spearman相關分析等級資料，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank分析確定生存率差別。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Beclin 1過表達對胃癌細胞惡性增殖和細胞周期的影響

RT-PCR和Western blot結果提示，Beclin 1質粒在MKN28細胞中成功表達，Beclin 1mRNA和蛋白均表達增高（圖1A），陰性和空白對照組細胞增殖速度要快于Beclin 1轉染體（圖1B），PI染色結果顯示穩定轉染Beclin 1的胃癌細胞出現了G2期阻滯（圖1C、1D）。

圖1 Beclin 1過表達影響胃癌細胞的增殖Fig.1 Influence of Beclin 1 overexpression on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 胃癌發生中Beclin 1mRNA和蛋白表達

如圖2所示，Beclin 1mRNA信號主要定位于黏膜上皮腺體和胃癌細胞胞質中。統計結果顯示，原發癌（81.6%，31/38）中Beclin 1mRNA表達高于癌旁黏膜（64.6%，31/48）（P＜0.05），而原發癌與淋巴結轉移灶（93.3%，28/30）中Beclin 1mRNA表達未見統計學差異（P＞0.05），見表1。Beclin 1蛋白定位于淺表腸化生黏膜上皮細胞和胃癌細胞胞質中，統計結果表明癌旁黏膜（60.1%，352/586）、原發癌（56.6%，320/565）和淋巴結轉移灶（52.7%，88/167）中Beclin 1蛋白表達無統計學差異（P＞0.05）。見表2。

2.3 Beclin 1表達與胃癌病理特征和預后的關系

如表3所示，Beclin 1蛋白表達與胃癌遠處轉移呈負相關（P＜0.05），與患者腫瘤侵襲深度、淋巴和靜脈侵襲、淋巴結轉移和TNM分期無顯著相關性（P＞0.05），Beclin 1表達多見于老年男性（P＜0.05），彌漫型胃癌中Beclin 1表達低于腸型和混合型（P＜0.05）。隨訪504例胃癌患者，中位生存時間68.5個月，Kaplan-Meier分析顯示Beclin 1表達與胃癌患者良好預后呈正相關（P＜0.05，圖3）。

3 討論

Beclin 1是自噬小泡必需的自噬蛋白，能夠參與細胞正常生理生長，阻礙細胞周期演進，誘導細胞自噬［2，3］。與結直腸癌的結果一致［4］，胃癌中Beclin 1 mRNA表達上調，提示Beclin 1轉錄水平上調參與胃黏膜上皮細胞惡性轉化過程，該過程可能為了抑制胃癌惡性行為的反應性升高。此外，本研究發現胃癌和黏膜中Beclin 1蛋白表達水平接近，Beclin 1 mRNA化學穩定性、翻譯和翻譯后降解可為此提供科學的解釋。胃癌組織中Beclin 1蛋白表達陽性率僅為50%，靶向敲除Beclin 1可以作為制備自發胃腫瘤模型的策略（工作正在進行中），而且監控Beclin 1表達可以作為其靶向治療適應證篩選的方法。

圖2 胃癌和癌旁黏膜組織中Beclin 1 mRNA和蛋白表達Fig.2 The mRNA and protein expression of Beclin 1in gastric cancer and mucosa

表1 胃癌發生和發展過程中Beclin 1mRNA表達Tab.1 Beclin 1mRNA expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

表2 Beclin 1蛋白在胃癌發生和發展過程中的表達Tab.2 Beclin 1 protein expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

圖3 Beclin 1蛋白表達與胃癌患者預后的關系Fig.3 Correlation between Beclin 1 status and prognosis of the gastric cancer patients

本研究發現，Beclin 1表達與胃癌遠處轉移呈負相關，提示胃癌中抑癌基因Beclin 1表達可能發揮轉移抑制作用。研究表明，Beclin 1低表達與肝內膽管癌的淋巴結轉移［5］、非小細胞肺癌腫塊大?。?］以及胰腺導管腺癌遠處轉移［7］顯著相關。有文獻［4，8］報道，結直腸癌中Beclin 1表達與遠處轉移和肝轉移呈負相關，Beclin 1過表達減慢了結腸癌細胞的增殖并使細胞周期在G1期阻滯，與本研究結果相一致。此外，本研究發現彌漫型胃癌中Beclin 1表達低于腸型胃癌，說明Beclin 1差異表達是胃癌分化的分子基礎。在此，我們也發現Beclin 1表達水平與胃癌良好預后呈正相關，與肝內膽管細胞癌［6］、胰腺導管腺癌［7］、ⅢB結腸癌［9］和鼻型結外自然殺傷T細胞淋巴瘤［10］的報道一致，提示Beclin 1對于反映胃癌患者良好預后來說是一個很好的分子標志。

本課題組一系列實驗結果表明Beclin 1表達參與胃癌發生過程，其表達下調與胃癌遠處轉移、去分化和不良預后關系密切，可以作為預警胃癌發生和預后的分子標志，因其可抑制增殖和細胞周期演進，所以可作為胃癌基因治療的靶標。

［1］Zheng HC，Li XH，Hara T，et al.Mixed-type gastric carcinomas exhibit more aggressive features and indicate the histogenesis of carcinomas［J］.Virchows Arch，2008，452（5）：525-534.

表3 胃癌中Beclin 1蛋白表達與其臨床病理特征的關系Tab.3 Relationship between Beclin 1 protein expression of gastric cancer and its clinicopathological features

［2］Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2011，18（4）：571-580.

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（編輯 陳 姜）

Clinicopathological Significance and Relevant Molecular Mechanisms of Beclin 1 in Gastric Cancer

ZHENG Hua-chuan，SHEN Dao-fu，YANG Xue-feng，SHI Shuai，GAO Yang，ZHAO Shuang，ZHANG Wen-lu

（Cancer Center，Key Laboratory of Brain and Spinal Cord Injury of Liaoning Province，Laboratory Animal Center，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo explore the role of Beclin 1 in gastric carcinogenesis and subsequent progression.MethodsMKN28 cells were transfected with Beclin 1-expressing plasmid，and then the proliferation and cell cycle was measured by CCK-8 and PI staining.Beclin 1 expression was examined by immunohistochemistry and in situ hybridization on tissue microarrays containing gastric cancers，adjacent non-neoplastic mucosa，and metastatic lymph node.The correlation with the tumorgenesis，clinicopathological and prognostic parameters was analyzed.ResultsBeclin 1 overexpression resulted in G2arrest of MKN28 cells and reduced the proliferation.Beclin 1 mRNAwas highly expressed in gastric cancer than matched mucosa by ISH（P＜0.05）.Beclin 1 was highly expressed in male than female patients with gastric cancer（P＜0.05）.The elder patients with gastric cancer had higher Beclin 1 expression than younger ones（P＜0.05）.The diffuse-type carcinomas showed less Beclin 1 expression than intestinal and mixed type ones（P＜0.05）.Kaplan-Meier analysis indicated that Beclin 1 expression was positively correlated to favorable prognosis of the cancer patients（P＜0.05）.ConclusionBeclin 1 expression is closely linked to pathogenesis，metastasis and differentiation ofgastric cancer.Beclin 1 mightbe employed to indicate the favorable prognosis of gastric cancer patients and regarded as a target of gene therapy.

gastric cancer；Beclin 1；pathogenesis；progression；prognosis

R731

A

0258-4646（2015）12-1061-05

國家自然科學基金（81172371，81472544）；遼寧省教育廳優秀人才計劃（LJQ2014093）；遼寧省科學技術廳2012年博士啟動資助項目（20121095）；遼寧醫學院2012年博士啟動項目（Y2012B018）；遼寧醫學院校長基金（XZJJ20140201，XZJJ20140203）

鄭華川（1975-），男，教授，博士.

E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2015-03-24

網絡出版時間：