原發性舍格倫綜合征患者Th22細胞及其細胞因子IL-22的表達及意義

王天祥，李金龍，柳洪志，王秋旭

（1.大慶油田總醫院口腔頜面外科，黑龍江 大慶 163001；2.佳木斯大學口腔醫學院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.中國醫科大學附屬盛京醫院口腔科，沈陽 110004）

原發性舍格倫綜合征患者Th22細胞及其細胞因子IL-22的表達及意義

王天祥1，李金龍2，柳洪志1，王秋旭3

（1.大慶油田總醫院口腔頜面外科，黑龍江 大慶 163001；2.佳木斯大學口腔醫學院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.中國醫科大學附屬盛京醫院口腔科，沈陽 110004）

目的探討Th22細胞及其細胞因子白細胞介素22（IL-22）在原發性舍格倫綜合征（pSS）患者外周血中的表達及臨床意義。方法pSS患者根據唾液腺受累程度分為輕、中、重度患者。健康成人作為對照組。檢測Th22細胞及其細胞因子IL-22在輕、中、重度pSS患者和健康對照組外周血中的表達。結果pSS患者外周血中Th22細胞及細胞因子IL-22表達明顯高于健康對照組（P＜0.05）。而且患者病情越嚴重，外周血中Th22細胞及細胞因子IL-22水平越高：重度組高于中度組（P＜0.05），中度組高于輕度組（P＜0.05）。結論pSS患者外周血中Th22及其細胞因子IL-22較健康對照組明顯升高，而且病情越嚴重，Th22及其細胞因子IL-22水平越高。因此，檢測外周血中Th22及其細胞因子IL-22水平有可能成為判斷pSS病情嚴重程度的指標，并為治療提供新的治療靶點。

原發性舍格倫綜合征；Th22；IL-22

原發性舍格倫綜合征（primary Sj?gren′s syndrome，pSS）是外分泌腺進行性破壞導致黏膜及結膜干燥的一種自身免疫性疾?。?］。臨床表現為長時間的口腔及眼部黏膜干燥、腮腺及其他外分泌腺體腫大，嚴重的甚至可累及神經系統等多個系統和臟器。本研究旨在明確健康人群及不同病變程度的pSS患者外周血中Th22及其細胞因子白細胞介素22（interlukin-22，IL-22）的表達情況，為pSS的診斷及治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2012年9月至2014年12月于大慶市油田總醫院口腔科及風濕免疫科確診pSS患者共90例。男性32例，女性58例；年齡22～75歲，其中22～＜40歲14例，40～＜60歲59例，≥60歲17例。均符合pSS修訂診斷標準。對照組18例，均來自健康獻血者，且無自身免疫病史。

1.2 納入標準

采用2002年國際診斷分類標準［2］，診斷項目包括：（1）口腔癥狀；（2）眼部癥狀；（3）眼部體征；（4）組織學檢查；（5）涎腺受損；（6）抗SSA/SSB抗體（+）。其中有4項指標提示陽性，即可診斷為pSS。

1.3 方法

1.3.1 分組：通過锝腮腺動態顯像檢測將pSS患者分為輕、中、重3組，見表1?；颊呷⊙雠P位，靜脈注射99m锝（99mTcO4-）185 MBq（5mCi），注射后用配有低能平行孔準直器SPECT（單光子發射器計算機斷層）進行唾液腺動、靜態顯像，放大倍數1∶1.6，以1幀/min速度連續采集40幀，第30分時給患者口含VitC粉300 mg，第40分時分別左、右側位和正位唾液腺顯像，將所得結果應用計算機ROI程序（感興趣區）進行定量分析。

表1 99m锝動態顯像檢測將pSS患者分為輕、中、重3組Tab.1 The pSS patients were divided into mild，moderate and severe groups according to the 99mTc scintigraphy analysis

圖1 Th22、Th17在pSS和健康人外周血中的表達Fig.1 Th22 and Th17 expression in peripheral blood of pSS and healthy individuals

1.3.2 分離及培養外周血單個核細胞：取外周血，去血漿，用淋巴分離液分離出人外周血單核細胞層，分離出的液體可形成4層，自上而下依次是血漿和組織勻漿液層、環狀乳白色淋巴細胞或單核細胞層、透明分離液層和紅細胞層。小心取出中間白膜層（單核細胞層），即為PBMC層。然后將PBMC接種到培養板里孵育4 h。

1.3.3 流式檢測：將孵育好的PBMC培養板內的細胞制懸液，分別移至流式管中，分別加入4 μL CD4-PerCP，后分別固定劑、破膜劑，再分別加入1 μL IL-17-Alexa-Flour，IL-22-PE室溫孵育30 min，將染色后的細胞群通過前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光信號進行設門，并用Flowjo 7.6.1軟件分析各細胞亞群的比例。

1.3.4 ELISA法檢測pSS實驗組和對照組血清中IL-22的表達：抽取患者外周血2 mL，加入EDTA抗凝，通過離心方法取得上部分血清后凍存（-20℃），ELISA法（按試劑盒說明書操作）檢測實驗組和對照組血清中的IL-22水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行正態性檢驗，實驗數據呈正態分布，用描述，并進行兩獨立樣本t檢驗；PASI評分呈偏態分布，應用Spearman法進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測外周血Th22、Th17細胞的水平結果

外周血Th22比對照組健康人顯著升高（P＜0.01）。不僅如此，我們還發現隨著病情的加重，Th22細胞頻率逐漸升高（P＜0.01），而Th17細胞的表達在輕、中、重3組之間無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 ELISA法檢測結果

血清中IL-22的濃度結果見表2，pSS患者血清中IL-22的濃度顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著病情的加重，IL-22的濃度逐漸增多。

表2 不同組別中IL-22水平的比較Tab.2 Comparison of the levels of IL-22 in different groups

2.3 Th22細胞頻率與細胞因子IL-22濃度的相關性結果

pSS患者血清中IL-22的濃度與Th22細胞比率呈正相關（R=0.375，P=0.022 3），見圖2。

圖2 Th22和IL-22的相關性Fig.2 The relationship between Th22 and IL-22

3 討論

pSS的發生可以分為3個連續的階段：第一階段是起始期，一系列異常的基因、生理和生化因素導致涎腺細胞新生減少和凋亡增加［3］，此階段尚不能檢測到明顯的自身免疫反應；第二階段是確立期，腺上皮細胞的凋亡引發了自身免疫反應，白細胞浸潤并表達致炎因子，形成淋巴濾泡，濾泡中開始是以T細胞為主，后來B細胞增多，并出現自身免疫抗體［4］；第三階段是臨床期，開始表現出各種臨床癥狀，涎腺和淚腺分泌功能障礙。由于pSS發病機制的復雜性，很多學者針對T淋巴細胞的各種亞型在發病過程中所發揮的作用分別進行了研究，已經證實了T輔助淋巴細胞中的Th1細胞和Th2細胞與pSS的發病密切相關，而Treg/Th17之間的動態平衡可以影響免疫系統的反應模式［5］。

Th22細胞是一群新型CD4+輔助T細胞，它相對獨立于Th1、Th2及Th17細胞，是一種CD4+效應T細胞亞群，源于Th0細胞。Eyerich等［6］應用免疫學等方法進行研究，結果表明Th22不僅有不同于其他T細胞的生長和分化的調節機制，而且具有特殊的信息傳導方式和穩定的效應因子，更特殊的是Th22的基因編碼的蛋白和趨化因子與組織的重塑和新血管的生成有密切的關系。所以Th22是一群獨立的有特殊功能的輔助T細胞亞群。在某種特定的條件下，一部分Th22細胞可以轉化成為其他效應的T細胞亞群。Th22細胞可以表達CCR4、CCR6和CCRl0。T細胞亞群是一個多樣化的細胞群，它包括Th1、Th9、Th17等，這些T細胞間存在著一種相互促進相互制約的復雜的調控機制，這是一種非常復雜的平衡，Th22細胞是T細胞亞群中的新成員，對于它的研究還很少，自身免疫性疾病病理機制以及治療等的研究可以通過深入對Th22細胞的生長、分化、生理、病理以及與其他T細胞之間的調控關系的研究，得到新的啟發，對于一些自身免疫疾病的治療也具有重要的意義。隨著對Th22研究的不斷加深，越來越多的研究表明，Th22及其細胞因子IL-22在皮膚、腫瘤、自身免疫等疾病中起著舉足輕重的作用。

Th22細胞產生IL-22，不產生IL-4、IL-17和IFN-γ。近期有研究［7］認為Th22細胞是IL-22的重要來源，且本實驗的實驗結果看到二者具有的正相關關系也證明了這一點。IL-22是一種新穎的免疫介質，由免疫細胞產生，卻不影響這些細胞，而是調節特定組織細胞的功能［8］。有研究［9］發現在克羅恩氏病患者的外周血中也存在大量的IL-22，并且IL-22的血清水平和疾病的活動性呈正相關。IL-22在類風濕性關節炎中的表達也有描述，在類風濕性關節炎的研究中［10］，滑液組織中IL-22及外周血中IL-22+ CD4+細胞的表達明顯增加?？傊?，IL-22可以使組織細胞的固有免疫反應得到增強，而且還具有保護組織受損及增強組織再生等功能。

近年來Th22細胞及其細胞因子IL-22在自身免疫性疾病中的作用成為新的研究熱點，本實驗檢測了Th22細胞及其細胞因子IL-22在健康者、腺體破壞輕、中、重3種程度的pSS患者外周血中的表達變化，圖1結果顯示患者外周血Th22細胞頻率比對照組健康人顯著升高（P＜0.000 2）。不僅如此，我們還發現隨著病情的加重，Th22細胞頻率逐漸升高（P＜0.000 1），而Th17細胞的表達在輕、中、重3組之間無顯著性差異（P＞0.05）。對照組Th17和Th22細胞水平分別為0.825%和0.672%（圖1A）；pSS輕度組Th17和Th22細胞水平分別為0.893%和2.754%（圖1B）；pSS中度組Th17和Th22細胞水平分別為0.979%和3.087%（圖1C）；pSS重度組Th17和Th22細胞水平分別為0.899%和7.749%（圖1D）。表2表明患者血清中IL-22的濃度顯著高于對照組（P=0.031 0），且隨著病情的加重，IL-22的濃度逐漸增多。實驗還發現pSS患者血清中IL-22的濃度與 Th22細胞比率呈正相關（r=0.325，P= 0.022 3，圖2）。深入研究Th22細胞和IL-22在不同程度患者中外周血中的表達，明確其相關性，可能為揭示pSS的發病機制及治療提供新的依據，有利于開發新的免疫調節藥物。由實驗結果推斷，通過對pSS患者Th22細胞的活性進行調節或者通過一些手段阻斷IL-22的效應通路，可能會延緩pSS患者病情發展，為pSS的治療提供新的方向。

［1］孔令華，嚴春雷，潘穎.干燥綜合征54例唾液腺核素顯像定量分析與高頻超聲及唇腺活檢對比研究［J］.交通醫學，2011，25（2）：133-136.

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（編輯 裘孝琦）

Clinical Significance of IL-22 Expression and Percentage of IL-22-producing Th22 Cellsin Primary Sj?gren′s Syndrome

WANG Tian-xiang1，LIJin-long2，LIU Hong-zhi1，WANG Qiu-xu3

（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Daqing Oilfield General Hospital，Daqing 163001，China；2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；3.Department of Stomatology Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo measure the percentage of Th22 cells and evaluate the levels of plasma interlukin-22（IL-22）in human peripheral blood，so as to determine their clinical significance in primary Sj?gren′s syndrome（pSS）.MethodsPatients with pSS were divided into three subgroups based on severity of labial gland involvement：mild，moderate and severe.Healthy people served as controls.The percentage of Th22 cells and the levels of IL-22 in human peripheral blood from pSS patients and healthy controls were measured and compared.ResultsCompared to healthy controls，pSS patients had significantly higher percentage of Th22 cells and higher plasma IL-22 levels（P＜0.05）.Among pSS patients，the more serious illness they had，the higher percentage of Th22 cell and levels of IL-22 were observed.Severe patients had higher percentage of Th22 cells and IL -22 levels than moderate patients（P＜0.05），and moderate patients had higher percentage of Th22 cells and IL-22 levels than mild patients（P＜0.05）.ConclusionIncreased peripheral IL-22-secreting Th22 cells are detected in primary Sj?gren′s syndrome，which have a close association with disease severity.These data suggest that Th22 and its released cytokine IL-22 may be considered as potential valuable biomarkers for severity of pSS，which may provide a novel therapeutic target for treatment.

primary Sj?gren′s syndrome；Th22；IL-22

R782.7

A

0258-4646（2015）12-

遼寧省科學技術計劃（2011010215-404）

王天祥（1976-），男，副主任醫師，碩士.

王秋旭，E-mail：wangqx@sj-hospital.org

2015-03-30

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