不同強度耐力運動對大鼠心房TGF-β1/miR-21信號途徑的影響

王世強，常 蕓，馬曉雯，饒志堅

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不同強度耐力運動對大鼠心房TGF-β1/miR-21信號途徑的影響

王世強1,2，常 蕓1，馬曉雯1，饒志堅1,2

目的：通過建立長期大強度運動動物模型，研究不同強度耐力運動對大鼠心房羥脯氨酸含量的影響以及TGF-β1/miR-21信號途徑的調節作用，為運動性心房纖顫的發生機制提供實驗依據。方法：72只健康成年雄性SD大鼠隨機分為安靜組、中等強度組和大強度組，每組24只。分別進行8周、12周和16周運動，每周訓練5天，休息2天，每次運動1 h。運動8周、12周和16周后24 h內處死取材摘取心臟，分離出右心房。采用酶聯免疫法檢測血清cTnI的含量；樣本堿水解法檢測羥脯氨酸的含量；熒光定量PCR檢測TGF-β1和miR-21的含量。Western Blot檢測TGF-β1蛋白表達。結果：大強度組8周、12周和16周大鼠血清cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強度組(P<0.01)，中等強度組8周、12周和16周大鼠cTnI的含量均無顯著變化。8周運動后，各組之間羥脯氨酸的含量無明顯差異；12周和16周大強度組羥脯氨酸的含量顯著高于各自的安靜組和中等強度組(P<0.01)，中等強度組和安靜組之間沒有顯著性差異。隨著運動時間延長，大強度組羥脯氨酸的含量有逐漸增加趨勢，16周羥脯氨酸的含量顯著高于8周大強度組(P<0.05)。8周、12周和16周大強度組TGF-β1基因和蛋白的表達均顯著高于各自安靜組，而中等強度組和安靜組之間TGF-β1的表達無明顯差異。隨著運動時間延長，大強度組TGF-β1的含量有逐漸降低的趨勢。8周、12周和16周運動后，與各自安靜組相比，大強度組miR-21的表達均顯著性增加(P<0.05)，隨著運動時間延長，大強度組miR-21的含量有逐漸降低的趨勢，16周大強度組miR-21的表達顯著低于8周大強度組(P<0.05)，中等強度組和安靜組之間miR-21的表達無明顯差異。結論：長期大強度運動導致大鼠心肌損傷長期存在，并伴隨大鼠心房膠原蛋白的持續增加，誘發了心房纖維化，構成了運動性心房纖顫的病理基礎。長期大強度運動通過上調大鼠心房TGF-β1/miR-21信號通路，可能介導了運動性心房損傷纖維化的發生。

運動；鼠；心房纖維化；羥脯氨酸；轉化生長因子；microRNA-21

有流行病學研究表明，長期從事耐力運動項目運動員心房纖顫(房顫)的發生率明顯高于其他項目運動員[2,3]。有調查研究發現，耐力運動員房顫的發生率在0.3%～12.8%之間，遠高于正常人群[49]。研究發現，耐力運動員房顫的發生與從事大強度運動的累積時間呈正相關[36]。以往多數研究認為，長期大強度運動造成的炎癥反應、心房擴張、自主神經系統發生變化和電解質紊亂是造成房顫的重要發生機制[39,44,50]。近年的一些研究證實，長期大強度運動造成心肌損傷并持續存在，最終導致心房纖維化，可能是房顫發生的重要病理變化[9,12,19,21]。有研究通過天狼星紅染色也發現，12周的大強度運動導致大鼠心房發生纖維化，且隨時間延長，纖維化的程度逐漸增高[5]。

心房纖維化是指心房中的膠原纖維異常增加的現象。過度增加的膠原纖維影響心肌細胞間的電信號傳導，促使房顫的發生與維持[25]。研究表明，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在炎癥和組織修復等方面具有重要作用，是最主要的促纖維化調節因子[52]。TGF-β1可通過促進心肌成纖維細胞增殖并轉化為肌成纖維細胞，使成纖維細胞合成細胞外基質(主要為膠原蛋白)的合成能力增強，最終造成心肌纖維化的發生[38]。研究發現，miR-21介導了TGF-β1誘導的炎癥和損傷后纖維化的發生過程[18]。Yao等發現，miR-21促進心肌組織中成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，參與調節了TGF-β1誘導的心肌纖維化的發生過程[53]。目前，關于運動強度和運動時間對心房TGF-β1/miR-21信號途徑的影響尚無文獻報道。本研究擬通過觀察不同運動強度和時間對心房TGF-β1和miR-21的影響，探討其在運動性心房纖維化中的作用，為研究運動性心房纖顫的發生機制提供實驗依據，也為篩選安全有效的預防和治療運動性心房纖顫的有效治療靶點和干預措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠72只，體重為(220±8 g)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXX(京)2012-0001。所有大鼠均以嚙齒類動物普通飼料喂養，在國家體育總局體育科學研究所ABSL-3級動物房飼養，室溫為22±2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12 h。

1.2 分組和運動方案

1.3 取材

大鼠運動8周、12周和16周后24 h內進行取材。迅速取出心臟，切取右心房，每塊組織分為2份，其中1份用于羥脯氨酸含量的檢測，另1份放入-80℃冰箱用于做RT-PCR和Western blot。

1.4 Elisa檢測血清cTnI的含量

采用雙抗體夾心法，大鼠cTnI單抗包被在96孔酶標板內，依次加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗、標準品、樣品，經溫育形成抗原-抗體反應體系與過氧化物酶復合物并經過洗滌后，加入底物TMB顯色，顏色呈藍色，最后加入終止液后，液體顏色呈現黃色。樣品中cTnI的濃度與顏色的深淺呈正相關。在Multiskan MK3酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)450色nm處測定OD值，通過繪制標準曲線求出血清中cTnI的濃度。Elisa試劑盒購于Life Diagnostics公司。

1.5 羥脯氨酸含量的檢測(樣本堿水解法)

羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈紫色，根據其呈色的深淺可推算其含量。稱量組織放入試管中，加入水解液，混勻，加蓋后95℃或者沸水浴水解20 min。調pH值至6.0～6.8，加入雙蒸水，混勻，加入適量活性炭，混勻。按表1添加完3種試劑后，60℃水浴15 min，冷卻后3 500 r/min離心10 min，取上清在波長550 nm處測定各管吸光度值。試劑盒購于南京建成生物工程研究所(貨號A030-2)。

表1 本研究Hyp含量測定操作一覽表

Table 1 Schedule Table of Determination of Hyp Content

空白管標準管測定管雙蒸水1ml標準液1ml檢測液1ml試劑1試劑20.5ml0.5ml(混勻,靜置10min)0.5ml試劑30.5ml0.5ml(混勻,靜置10min)0.5ml

計算公式：

1.6 RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA的表達

采用Trizol法(購于美國Technologies)提取總RNA，每個樣本按照2 μg RNA作為初始模板，配置20 μl的總反應體系，應用cDNA合成試劑盒(RR370A，購于TaKaRa公司)在核酸擴增儀(Gene Amp PCR System 9700，美國ABI公司)進行反轉錄成cDNA，反應條件為：37℃，15min；85℃ 5s；4℃保持。以合成的cDNA作為模板，以β-actin作為內參，配置20 μl反應體系，每個樣本檢測3個復孔，在實時熒光定量PCR系統(7300，美國ABI)進行擴增熒光定量，反應條件為：預變性95℃，30 s；PCR反應95℃，5 s；60℃，31 s；40個循環。熒光定量試劑盒為TaKaRa公司的RR820A。根據收集的數據通過2-△△CT公式計算樣本中mRNA的相對含量，其中△△CT=(CT實驗組目的基因-CT實驗組內參基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組內參基因)。實驗所需引物由上海生工生物合成。

1.7 RT-PCR檢測miR-21的表達

采用Trizol法(購于美國Technologies)提取總RNA，每個樣本按照2 μg RNA作為初始模板，配置20 μl的總反應體系，采用在miRNA3′末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-univerl tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，最終反轉錄生成cDNA。以合成的cDNA為模板，以U6作為內參基因，配置20 μl反應體系，每個樣本設置3個復孔，在實時熒光定量PCR系統進行擴增熒光定量，反應條件為：94℃，2 min，起始模板變性；94℃，20 s，PCR循環中模板變性，60℃，34 s，退火、延伸，40個循環。反轉錄、熒光定量試劑盒和miRNA引物均購于天根生化科技(北京)有限公司。根據收集的數據通過2-△△CT公式計算樣本中miRNA的相對含量。

表2 本研究RT-PCR檢測TGF-β1引物序列一覽表

Table 2 Primer Sequence of TGF-β1 Detection by RT-PCR

引物序列長度β-actin上游引物5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'105bp下游引物5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'TGF-β1上游引物5'-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3'120bp下游引物5'-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3'

表3 本研究Real-time PCR檢測miR-21引物序列一覽表

Table 3 Primer Sequence of miR-21 Detection by RT-PCR

引物序列長度U6上游引物5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'105bpmiR-21上游引物5'-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3'120bp

1.8 Western Blot法檢測心房TGF-β1的蛋白表達

提取總蛋白后用BCA法測定并調整蛋白濃度一致后，加入上樣緩沖液沸水中10 min使蛋白變性。120 V恒壓SDS-PAGE電泳1 h后，200 mA恒流轉膜1 h。5%脫脂奶粉(購于美國BD公司)封閉1 h，一抗(Anti-TGF-β1，內參為β-actin,購于美國Abcam公司)置于搖床4℃過夜。TBST洗滌3次后，加HRP標記的二抗(1∶5 000，購于北京欣博盛公司)，室溫搖床孵育1 h。TBST洗膜3次，滴加ECL化學發光試劑(購于美國Millipore)，室溫靜置2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內封存，置于暗匣內，X光片曝光約1 min，顯影液中顯影2 min，定影數十秒，條帶用Quntity One軟件進行圖像分析。計算目的蛋白與內參蛋白條帶的積分光密度(IOD)的相對值。

1.9 統計學分析

2 實驗結果

2.1 大鼠血清cTnI的含量變化

結果如表4所示，與安靜組相比，中等強度組8周、12周和16周大鼠cTnI的含量均無顯著變化。而大強度組8周、12周和16周cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強度組(P<0.01)。不同時間各運動組之間無明顯差異。

表4 本研究大鼠血清cTnI含量的變化一覽表

Table 4 Change of Serum cTnI of Rats(ng/ml)

安靜組中等強度組大強度組8周0.66±0.110.71±0.181.14±0.25*#12周0.68±0.150.65±0.121.42±0.26*#16周0.61±0.070.70±0.171.32±0.33*#

注：*表示P<0.05，與安靜組相比；#表示P<0.05，與中強度組相比。

2.2 大鼠心房羥脯氨酸的含量變化

羥脯氨酸含量測量結果如圖1所示，8周運動后，各組之間羥脯氨酸含量無明顯改變。12周和16周大強度組羥脯氨酸含量顯著高于各自的安靜組和中等強度組(P<0.01)，中等強度組和安靜組之間沒有顯著性差異。大強度組大強度組之間通過比較發現，8周、12周和16周大強度組羥脯氨酸含量逐漸增加，16周羥脯氨酸含量顯著高于8周大強度組(P<0.05)。

圖1 本研究心房羥脯氨酸的含量示意圖

注：**P<0.01，與各自安靜組相比；##P<0.05，與各自中強度組相比；&P<0.05，與8周大強度組相比。

2.3 大鼠心房TGF-β1 mRNA的表達變化

熒光定量PCR結果如圖2所示，經過8周、12周和16周運動后，大強度組TGF-β1 mRNA含量均高于各自安靜組和中等強度組，和各自安靜組相比，均具有顯著性差異(P<0.05)，中等強度組TGF-β1 mRNA的含量也高于各自安靜組，但無統計學差異。

通過計算比較8周、12周和16周大強度組之間TGF-β1 mRNA的相對含量變化發現，12周和16周TGF-β1 mRNA的含量均顯著低于8周大強度組(P<0.05)，12周和16周之間無明顯差異(圖3)。

圖2 本研究心房TGF-β1 mRNA的相對含量示意圖

圖3 本研究大強度組心房 TGF-β1 mRNA的相對含量示意圖

2.4 大鼠心房TGF-β1 蛋白的表達變化

Western Blot結果如圖4所示，8周運動后大強度組TGF-β1含量顯著高于安靜組和中等強度組(P<0.01)。中等強度組TGF-β1的表達低于安靜組，但無顯著性差異；12周大強度組TGF-β1的含量顯著高于安靜組和中等強度組(P<0.05)，中等強度組TGF-β1的含量高于安靜組，無顯著性差異；16周大強度組TGF-β1的含量顯著高于安靜組和中等強度組(P<0.05)，中等強度組TGF-β1的含量略低于安靜組，但無顯著性差異。進一步比較各訓練周長之間大強度組TGF-β1 蛋白的含量發現，TGF-β1蛋白含量逐漸降低，12周和16周大強度組TGF-β1蛋白含量均顯著低于8周大強度組，12周和16周之間無明顯差異。

2.5 大鼠心房miR-21的表達變化

如圖5所示，熒光定量PCR檢測結果顯示，8周運動后，和安靜組相比，大強度組miR-21的表達增加3.29倍(P<0.05)，中等強度組增加0.45倍，但無顯著性差異；12周運動后，和安靜組相比，大強度組miR-21的表達增加2.58倍(P<0.05)，中等強度組增加0.16倍，但無顯著性差異；16周運動后，和安靜組相比，大強度組增加3.67倍(P<0.05)，中等強度組miR-21的表達增加1.2倍，但無顯著性差異。

圖4 本研究心房TGF-β1蛋白的含量變化示意圖

注：*P<0.05，**P<0.01，與各自安靜組相比；#P<0.05，##P<0.01，與各自中等強度組相比；&P<0.05，&&P<0.01，與8周大強度組相比。

如圖6所示，進一步比較8周、12周和16周大強度組之間miR-21的相對含量變化發現，miR-21的含量有逐漸降低的趨勢，16周大強度組miR-21的表達顯著低于8周大強度組(P<0.05)。

圖5 本研究心房miR-21的相對含量變化示意圖

注：*P<0.01，與各自安靜組相比；#P<0.05，與各自中等強度組相比。

圖6 本研究大強度組心房miR-21的相對含量示意圖

3 分析與討論

3.1 運動性心肌損傷、心房纖維化與房顫的研究

適當強度的運動可以降低心血管疾病的發病率，延長壽命，已經得到廣泛認可[41]。但不可忽視的是，長期從事高強度運動的耐力運動員心律失常的發生率顯著高于正常人群，由于其影響到運動員的身體健康、系統訓練以及比賽成績，并且耐力項目運動員和從事過大強度與大運動量訓練的運動員可出現嚴重的心律失常，甚至發生運動性猝死[1]。其中，運動員房顫和心房撲動的發生率較為顯著[13,34]。Abdulla等曾調查研究了655名耐力運動員(平均年齡為51±9歲)后發現，運動員房顫的發生率是普通人群的5.29倍[8]。Wernhart等的一項調查研究發現，耐力運動員孤立性心房纖顫的發生率在0.3%～12.8%之間，遠高于正常人群[49]。Molina等調查了252名男性馬拉松運動員后發現，運動員孤立性房顫的發生率顯著高于安靜對照人群(0.43% vs 0.11%)[33]。有研究報道，耐力運動員房顫的發生率是安靜對照人群的2～10倍，并且運動性心房纖顫的發生與從事大強度運動的累積時間密切相關[34，35]。Mystad等通過對3 545名越野滑雪運動員的調查發現，12.5%的調查對象存在房顫，且其發生率和累積運動時間成正相關[36]。另有研究報道，具有長期從事滑雪經歷的老齡運動人群(65～90歲)房顫的發生率顯著高于普通人群。Elosua等的研究發現，一生中總的運動時間累積超過1 500 h，房顫的易感性顯著增加[17]。

近年研究表明，長期大強度運動造成心房肌炎癥的持續存在和累積損傷，可誘發心肌纖維化，可能是運動性心房纖顫的重要病理機制。心房纖維化是指心房中的膠原纖維過度增加的現象。膠原纖維對維持心房肌細胞正常的生理功能具有重要作用，然而，過度增加的膠原纖維將影響心肌細胞的電信號傳導，促使房顫的發生與維持。Guasch等研究發現，16周每天進行1 h大強度運動的大鼠心房纖維化程度增加60%，房顫的易感性顯著高于安靜對照組(64% vs 15%)[21]。Benito等進一步研究發現，16周的大強度運動誘導心房纖維化相關因子顯著增加[12]。

羥脯氨酸為膠原纖維所特有，測定心房羥脯氨酸含量，通過換算可得出膠原蛋白的含量，反映心肌纖維化的程度。本研究發現，和安靜組比較，8周大強度組大鼠心房羥脯氨酸含量略有增加，而中等強度組羥脯氨酸含量降低，但均無顯著性差異。12周和16周運動后，大強度組羥脯氨酸含量均顯著高于安靜組和中等強度組。而中等強度組羥脯氨酸含量也高于安靜組，但兩者之間無明顯差異。通過天狼星紅染色研究發現，12周和16周大強度運動后，大鼠心房膠原容積分數(CVF)和Ⅰ型膠原蛋白顯著增加，心房發生纖維化[5]。

另外，本研究發現8周、12周和16周大強度運動后大鼠血清cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強度組，而中等強度組和安靜對照組之間cTnI的含量未有顯著差異。cTnI是心肌特異性和靈敏度較強的一種肌鈣蛋白，已成為檢測心肌損傷的“金標準”。本研究說明，不同周期的大強度運動造成大鼠心肌損傷持續存在。而心房肌細胞內肌纖維相對較少，肌漿網和橫管系統不發達且線粒體較少，長期大強度運動時，心房接受回流血量大，產生較大前負荷，對氧和能量需求較高，更易發生缺氧和損傷，細胞通透性增高，cTnI漏出入血。有學者研究也發現，反復力竭運動和大強度運動后大鼠血清cTnI的含量顯著增高，且與運動性心肌微損傷程度相關[4,29]。George等通過人體研究也發現，運動強度與cTnI的含量呈正相關[20]。因此，cTnI可以作為檢測和監控過度運動時心肌受損程度的有效指標。

本研究中發現，羥脯氨酸含量的顯著增加，可能是由于長期大強度運動后心肌損傷修復的長期累積所致。與本研究一致，Benito等發現，16周的大強度耐力運動誘導了大鼠右心室羥脯氨酸的顯著升高[12]。有文章也表明，6周的大強度游泳和跑臺運動造成了小鼠心房纖維化，是房顫易感性增加的重要原因[9]。

3.2 長期大強度運動上調TGF-β1/miR-21信號通路

研究表明，TGF-β1在調控炎癥反應和損傷后修復過程中具有重要作用，也是目前發現的最重要的促纖維化因子之一，其可通過促進細胞增殖、分化以及膠原蛋白的合成促進損傷后修復與纖維化的形成[54]。本研究發現，8周、12周和16周大強度運動后，大鼠心房TGF-β1基因和蛋白的表達均顯著增加，而中等強度運動后心房TGF-β1的變化不明顯。這可能是由于大強度運動對心房產生較大的機械負荷，造成心房組織中的成纖維細胞合成分泌較多的TGF-β1，誘導細胞外基質(主要為膠原蛋白)的合成與分泌增多。適度增多的膠原蛋白對防止心肌被過度拉伸具有保護作用，而長期反復的大強度運動造成TGF-β1的持續高表達導致細胞外基質的大量增加，心臟可能由生理性重塑向病理性重塑發展。過度增加的膠原蛋白誘發心肌纖維化，影響心臟的收縮和舒張功能以及心肌的順應性和僵硬度[42]。在組織損傷早期，TGF-β1的高表達在對組織損傷后的修復具有重要作用。然而，長期持續TGF-β1的異常表達反而會造成組織的過度修復，損傷部位可能發生纖維化。與本研究結果一致，徐明明等研究發現，急性跑臺運動后，大鼠骨骼肌在頓挫傷后修復過程中TGF-β1的表達顯著增加[7]。高曉嶙等研究也發現，TGF-β1在肌腱過度使用中長期高表達，可能是肌腱發生退行性病變的重要病理機制[6]。Heinemeier等研究也發現，急性大強度運動后骨骼肌中TGF-β1 mRNA的表達也顯著升高[24]。人體實驗研究也發現，耐力運動后血液里多種炎癥相關因子表達增加，TGF-β1的含量也顯著增加，但其是否來自于心肌細胞的釋放入血，仍需進一步研究[14,37]。

研究證實，劇烈或較大強度運動造成活性氧(ROS)的大量增加可上調TGF-β1的表達[38]。另外，大強度運動后血管緊張素的分泌增加也會造成TGF-β1的表達增加[16]。TGF-β1可通過p38MAPK途徑或者激活下游SMAD信號通路，激活生成膠原纖維的途徑，使成纖維化細胞增殖，細胞外基質的合成增加，誘發心房纖維化[28,51]。有研究也發現，16周的大強度運動后，大鼠心房結締組織生長因子(CTGF)的表達顯著增加[5]。而CTGF是TGF-β1重要的下游作用因子，可促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，在心房纖維化和心房纖顫的發生過程中也具有重要作用[30]。

研究發現，miR-21介導了TGF-β1的促炎和促纖維化過程。miR-21主要通過調控心臟成纖維細胞的增殖而參與心肌纖維化的過程[27]。研究顯示，在組織器官纖維化病變過程中miR-21表達顯著增加。Thum等通過原位雜交證實，心肌的miR-21選擇性的在成纖維細胞中表達。進一步研究顯示，miR-21表達的上調，能抑制Spry1的水平，從而增強ERK-MAP信號通路的活性，導致成纖維細胞的增殖，促進了心肌細胞纖維化的發生。在壓力負荷增加的動物模型中，用反義寡核苷酸antagomiRs抑制miR-21，心肌ERK-MAP激酶的活性降低。另外，Roy等在缺血再灌注動物模型中研究發現，miR-21在心肌成纖維細胞中表達升高，磷酸酶張力蛋白(PTEN)表達水平下調，進而激活磷脂?；?3-激酶(PI3K-Akt)信號通路[40]。PI3K-Akt通路的活化能上調基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)的活性，從而參與心肌纖維化的調節[43]。Ma等研究報道，8周的游泳訓練顯著上調大鼠左心室miR-21的表達，通過降解PTEN介導了運動性心肌肥大的發生[31]。但目前不同強度運動訓練對心房miR-21的影響的研究報道較少。本研究發現，8周、12周和16周大強度運動后，心房miR-21的表達均顯著增加，中等強度運動后，心房miR-21的表達也具有增加趨勢，但無顯著性差異。這表明，長期大強度運動導致的心房纖維化的形成可能與心肌中miR-21的長期高表達密切相關。

研究報道顯示，TGF-β1可通過調節miR-21的表達誘導炎癥反應和纖維化的形成。Madhyastha等通過體外研究發現，在高糖條件下，TGF-β1促進了皮膚成纖維細胞miR-21的表達[32]。He等發現在血吸蟲誘導的肝臟纖維化發生過程中，存在TGF-β1和miR-21的高表達，體內腺病毒轉染miR-21抑制劑可有效抑制肝纖維化的發展。進一步研究則發現，TGF-β1通過激活SMAD蛋白上調肝衛星細胞中miR-21的表達，而阻斷TGF-β1/Smad信號通路可顯著下調肝衛星細胞miR-21的表達[23]。Jiang等發現，輻射通過激活TGF-β1/miR-21信號通路，導致ROS增加，進而導致肺組織細胞DNA損傷[26]。Villar等發現，在壓力負荷過載小鼠模型中存在TGF-β1和miR-21同時高表達的現象[45]。同時，人體研究也發現，主動脈狹窄病人血漿中TGF-β1和miR-21的表達均顯著高于正常對照人群，miR-21與心組織切片中膠原的含量呈正相關。在心肌間質細胞而非心肌細胞存在miR-21的高表達[46]。García等進一步研究發現，在培養的心肌成纖維細胞中，TGF-β1的過表達通過激活SMAD2/3信號通路和DICER1共同作用促進前體miR-21加工為成熟的miR-21[18]。

有研究發現，急性力竭運動和長期耐力運動能顯著增加人體血液循環中TGF-β1[22,47]和miR-21[10,15,48]的含量，但其是否來源于心肌組織的釋放入血尚不明確。因此，深入研究運動與TGF-β1/miR-21的關系，對我們深入了解運動性心律失常的發生機制具有重要意義。本動物實驗研究對人類運動性心律失常的治療靶點和干預措施選擇提供了實驗依據和借鑒思路，但對于干預措施的應用仍有一段距離，還需要進一步的研究與臨床觀察。使用何種干預措施可以緩解過度運動造成的心房損傷和纖維化，將是本課題組進一步研究的方向。

綜上所述，本研究中發現，長期大強度運動后心房發生纖維化的現象可能與心肌發生反復損傷修復且長期累積有關，而長期中等強度運動未有纖維化的發生。研究中發現，心房組織中TGF-β1和miR-21的長期持續高表達可能參與調控了心房損傷后纖維化的發生，可能是運動性心房纖顫發生的重要機制之一。

4 結論

1.長期大強度耐力運動導致大鼠心肌損傷長期存在，并伴隨大鼠心房膠原蛋白的持續增加，誘發了心房纖維化，構成了運動性心房纖顫的病理基礎。

2.長期大強度耐力運動通過上調大鼠心房TGF-β1/miR-21信號通路，介導了運動性心房纖維化的發生過程。

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Effects of Endurance Exercise of Different Intensity on TGF-β1/miR-21 Signaling Pathpay

WANG Shi-qiang1,2,CHANG Yun1,MA Xiao-wen1,RAO Zhi-jian1,2

Objective:To explore effects of different sustained intensive exercise on rat atrial hydroxyproline,and role of TGF-β1/miR-21 signaling pathway through establishing long-term exercise animal model,and provide experimental evidence for clarifiying the mechanism of exercise-induced atrial fibrillation.Methods:72 SD rats were divided into control group (C),moderate intensity group (M) and high instensity group (H) with 24 animals in each group.M and H group were conditioned to run for 4,8,and 16 weeks,5 days/weeks,1h/day.Rats were euthanized to obtain hearts within 24h after exercise.Right atrial were collected.cTnI was quantified by Elisa,hydroxyproline was measured by lkali hydrolysis methodwhich.TGF-β1 and miR-21 gene expression were evaluted by real-time PCR.TGF-β1 protein was quantified by Western Blot.Results:Compared with control and M group,rats serum cTnI increased at 8 weeks/12 weeks/16 weeks (P<0.01).While there was no significance between M group and C gourp.There was no significant difference in hydroxyproline at 8 weeks.Compared with C and M group,hydroxyproline content of H group showed significant increase at 12 weeks and 16 weeks (P<0.01).No difference was oberserved between C group and M group.Hydroxyproline content of H group confirmed a gradual increase with training time,with significant increase from 8 weeks to 16weeks (P<0.05).TGF-β1 gene and protein expression of H group increased compared their control group at 8/12/16 weeks.But no difference was observed between C and M group.TGF-β1 expression had a gradual decrease from 8 to 16 weeks.Compared with their control group,miR-21 expressio of H group showed a significant increase (P<0.05).miR-21 of H group confirmed a gradual decrease with training time,with significant decrease from 8 weeks to 16weeks (P<0.05).No significant difference was observed beteen C and M group.Conclusion:Long-term intensive exercise induced sustained myocardial damage,resulted in sustained collagen increase which induced myocardial fibrosis.This may be a substrate for exercise-induced atrial fibrillation.TGF-β1/miR-21 signaling pathway,upregulated by long-term intensive exercise,may involve in the pathology of intense exercise-induced myocardial damage and atrial fibrillation.

exercise;rat;artrialfibrosis;hydroxyproline;TGF-β1;microRNA-21

2015-07-25；

2015-10-25

國家體育總局體育科學研究所基本科研業務經費(15-16)。

王世強(1987-)，男，山東濟寧人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心臟生理和病理，E-mail：suswsq@163.com；常蕓(1957-)，女，內蒙古人，研究員，醫學博士，博士研究生導師，主要研究方向為運動員心臟病生理與醫務監督，Tel：(010)87182526，E-mai：changyun@ciss.cn；馬曉雯(1989-)，女，北京人，在讀碩士研究生，主要研究方向為運動心臟生理和病理；饒志堅(1989-)，男，江西上饒人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心臟生理和病理。

1.國家體育總局體育科學研究所，北京，100061；2.上海體育學院 運動科學學院，上海 200438 1.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China；2.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438,China.

1000-677X(2015)11-0030-08

10.16469/j.css.201511005

G804.5

A