粗皮桉ISSR-PCR反應體系優化

陳升侃，項東云，鄧紫宇，梁建新，藍必布，李昌榮，梁 機

?

粗皮桉ISSR-PCR反應體系優化

陳升侃1,2，項東云2，鄧紫宇2，梁建新3，藍必布3，李昌榮2，梁 機1,2＊

(1. 廣西大學林學院，廣西南寧530004；2. 廣西優良用材林資源培育重點實驗室廣西林科院，廣西南寧530002；3. 廣西國有大桂山林場，廣西賀州 542800)

為建立粗皮桉ISSR-PCR優化反應體系，先通過單因素試驗確定影響粗皮桉ISSR-PCR 5個因素(Mg2+、dNTP、DNA聚合酶、DNA模板、引物)的較適宜濃度范圍，在此基礎上進一步通過正交試驗對5個因素4個水平進行優化，并用DPS軟件分析試驗結果。結果表明粗皮桉ISSR-PCR的優反應體系為：在25 μL反應體系中，10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl 2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、DNA聚合酶1.25 U、DNA模板60 ng、引物0.8 μmol·L-1。通過梯度試驗確定的擴增程序為：94℃預變性5 min，然后按94℃變性1 min，51℃退火3 min，72℃延伸2 min，進行35個循環，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

粗皮桉；ISSR-PCR；體系優化；單因素試驗；正交試驗

粗皮桉()是桃金娘科(Myrta-ceae)桉樹屬樹種，天然分布于澳大利亞，是重要的用材樹種和優良的水源涵養樹種，其木材呈紅色至深紅色，堅固而耐久，被廣泛用于建筑、枕木、造船等用材。該樹種樹皮厚、抗逆性強、木材密度良好，目前已被廣泛引種于廣東、廣西及海南地區[1-2]。對粗皮桉的研究主要集中于種源試驗[3-5]、木材材性及加工利用方面[6-13]，同時也有學者從粗皮桉的化學組成特性、抗風與生長等進行了研究[14-15]。

簡單序列重復區間(Inter-simple sequence repeat，ISSR)，由加拿大蒙特利大學的Zietkiewicz等[16]于1994年提出，是一種基于SSR的簡單重復序列區間擴增多態性分子標記。它具有模板需求量少、試驗操作簡單、試驗成本低、多態性豐富好、快速高效等優點[17]。ISSR分子標記技術已被廣泛用于遺傳多樣性[18-19]、遺傳圖譜構建[20-21]品種親緣關系及分類[22]等研究中，但前提是要建立一個擴增效果較好的PCR反應體系，曾艷玲等[23]以鄧恩桉()為材料建立了ISSR-PCR的優化體系，但不同樹種對PCR反應條件的要求不一樣，粗皮桉的ISSR-PCR優化反應體系還有待進一步研究。本文利用單因素試驗和正交試驗雙重試驗方法[24]對粗皮桉ISSR-PCR反應體系進行優化。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以粗皮桉嫩葉所提取的DNA為模板進行體系優化，其材料取自廣西國有東門林場。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒，DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，10×PCR buffer，引物參照哥倫比亞大學UBC公司2006年公布的ISSR引物序列，經初步篩選出的858號引物，即(TGT)5GRT(其中R為A或G)，I型核酸染色劑，瓊脂糖，1×TBE。

1.2.1 主要儀器

Sigma 3-30k離心機，Professional Thermocycler型PCR儀，DYY-6D型電泳儀，BIO-RAD凝膠成像系統，超微量核酸蛋白檢測儀ND-2000。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗皮桉基因組DNA的提取

采用北京天根生化科技有限公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒提取粗皮桉DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并用超微量核酸蛋白檢測儀ND-2000檢測DNA的濃度和純度。最后將樣品稀釋成10 mg·L-1，用于ISSR反應體系的優化試驗。

1.3.2 ISSR-PCR擴增反應單因素試驗

反應體系的優化先按照單因素梯度設計進行(表1)，優化影響ISSR-PCR反應的5個主要因素：Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、DNA模板、引物，在其他因素不變的條件下，變化單一因子，篩選出最適宜的濃度范圍，為進一步優化提供依據。ISSR基本反應體系組成：10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl23.0 mmol·L-1，DNA模板20 ng，引物0.2 μmol·L-1，DNA聚合酶0.5 U，dNTPs 0.2 mmol·L-1，最后用無菌超純水補足至25 μL。ISSR-PCR基本擴增程序：94℃預變性5 min，然后按94℃變性1 min，53℃退火3 min，72℃延伸2 min，進行35個循環，最后72℃延伸5 min，4℃保存。在優化前先進行預試驗，初步篩選擴增結果較好的引物，以便在優化時獲得較好的結果。取擴增產物10 μL和2 μL上樣緩沖液混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠的上樣孔里，以D3000 bp DNA ladder作為對照分子量標準，在1×TBE緩沖液中電壓5 V·cm-1電泳1.5 h，然后在BIO-RAD凝膠成像系統下拍照記錄，檢驗并分析優化結果。

表1 ISSR-PCR體系優化的因素與水平

1.3.3 ISSR-PCR熱循環反應參數梯度試驗

在單因素試驗優化后的反應體系下，以上述基本擴增程序為基礎，進行循環次數分別為20、25、30、35、40次的ISSR-PCR擴增試驗以確定最適宜的循環次數。設計5個退火溫度梯度：51℃、52℃、53℃、54℃、55℃，對引物進行退火溫度篩選，以便得出條帶豐富、清晰且穩定的引物并確定其優化體系的最適宜退火溫度。

1.3.4 ISSR-PCR反應因素水平的正交設計

正交試驗選用L16(45)正交表安排試驗(表2)，對Mg2+濃度、dNTP濃度、DNA聚合酶用量、DNA模板用量和引物濃度5個因素設計4個水平，各因素水平的設計參照單因素試驗得到的最適宜濃度范圍，各因素試驗重復3次。正交試驗的ISSR-PCR擴增程序為反應參數梯度試驗所得的優化擴增程序，PCR產物的檢測與單因素試驗相同。

表2 ISSR-PCR體系優化正交試驗設計L16(45)及試驗評分結果

1.4數據處理

正交試驗結果的處理采用打分方式[25]，評分標準為電泳結果譜帶的強弱、條帶數量、清晰度和雜帶數量，并以條帶強弱和數量為評分主體，從1 ~ 16依次排序打分。應用SAS軟件進行方差分析及Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 粗皮桉總DNA的提取

本研究采用現有的植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，通過電泳結果顯示(圖1)，所提取的DNA完整性較好。通過ND-2000核酸蛋白檢測儀檢測結果，所提取DNA的OD260/OD280均在1.7 ~ 2.0之間，說明所提取的DNA純度較高，符合ISSR-PCR擴增反應的要求。

圖1 部分粗皮桉DNA提取電泳檢測結果

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 Mg2+濃度對ISSR-PCR反應的影響

在PCR擴增反應中Mg2+對DNA聚合酶進行熱激活，其濃度大小影響酶的活性，并對退火溫度和解鏈溫度產生影響。試驗結果表明(圖2)，當Mg2+濃度為0.5 ~ 1.0 mmol·L-1時無法擴增出條帶(圖2泳道1 ~ 2)；濃度提高到1.5 mmol·L-1后，能夠擴增出產物但條帶較少(圖2泳道3)；濃度在2.0 ~ 4.0 mmol·L-1之間，擴增帶型一致，條帶豐富清晰(圖2泳道4 ~ 8)。故在進行正交試驗時，Mg2+濃度的水平設計取值范圍應當在2.0 ~ 4.0 mmol·L-1之間。

圖2 Mg2+濃度的影響

注：M泳道為Maker DL 3000，1 ~ 8泳道的濃度分別為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol·L-1

2.2.2 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應的影響

dNTPs是由dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4種等摩爾濃度混合而成，是PCR擴增反應的原材料，其濃度的變化直接影響到擴增產物的產量和特異性。試驗結果表明(圖3)，dNTPs濃度為0.05 mmol·L-1時，因濃度過低，擴增產物產量較低，無法分辨出所擴增的條帶(圖3泳道1)；即使濃度提高到0.10 mmol·L-1，條帶仍較模糊(圖3泳道2)；當濃度為0.15 ~ 0.30 mmol·L-1時，條帶較多，帶型一致，且主帶逐漸變亮(圖3泳道3 ~ 6)；若濃度繼續提高到0.35 mmol·L-1，主帶較亮，但缺失2條弱帶(圖3泳道7)；濃度高至0.40 mmol·L-1后僅擴增出1條帶。dNTPs濃度的適宜范圍在0.15 ~ 0.30 mmol·L-1，進行正交試驗的dNTPs濃度水平依據此濃度范圍。

圖3 dNTPs濃度的影響

注：M泳道為Maker DL 3000，1 ~ 8泳道的濃度分別為：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol·L-1

2.2.3DNA聚合酶用量對ISSR-PCR反應的影響

高溫嗜熱DNA聚合酶是PCR反應的重要組成成分，其活性和用量對PCR反應結果影響較大。DNA聚合酶用量較低，會導致因酶過早消耗完而使擴增產物得率較低；DNA聚合酶用量過高會導致非特異性產物增加。試驗結果表明(圖4)，DNA聚合酶的濃度在0.5 ~ 1.25 U·25 μL-1之間，擴增出的條帶豐富、帶型一致且較清晰(圖4泳道2 ~ 5)；而其他濃度所擴增出來的條帶較少且不清晰(圖4泳道1、6 ~ 8)。由此說明粗皮桉ISSR-PCR反應的DNA聚合酶最適宜用量在0.5 ~ 1.25 U·25 μL-1之間，以此用量范圍作為正交設計的試驗的依據。

圖4 Taq DNA聚合酶用量的影響

注：M泳道為Maker DL 3000，1 ~ 8泳道的用量分別為：0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 U·25 μL-1)

2.2.4 DNA模板用量對ISSR-PCR反應的影響

DNA模板的質量和數量是影響PCR反應的重要因素之一，模板應盡量純凈，避免受RNA、核酸酶、蛋白水解酶等的污染；DNA模板用量過多也會引起非特異性產物的增加。本試驗設置的DNA模板用量在10 ~ 100 ng之間，結果表明(圖5)，所有用量擴增的帶型一致，且主帶隨著模板用量的增加而明顯變亮；但用量為10 ~ 20 ng時，條帶均較暗，不夠清晰(圖5泳道1 ~ 2)，用量為80 ~ 100 ng時，有2條弱帶無法分辨(圖5泳道7 ~ 8)；而用量在30 ~ 60 ng之間，條帶則比較穩定且清晰(圖5泳道3 ~ 6)。故本研究正交試驗中DNA模板用量的4個水平設置為30、40、50、60 ng。

圖5 DNA模板用量的影響

注：M泳道為Maker DL3000，1 ~ 8泳道的用量分別為：10、20、30、40、50、60、80、100 ng·25 μL-1

2.2.5 引物濃度對ISSR-PCR反應的影響

引物濃度的高低也是影響PCR反應的因素之一。從圖6可看出，8個引物濃度梯度中，濃度在0.1 ~ 0.4 μmol·L-1之間均無法擴增出條帶(圖6泳道1 ~ 4)；濃度為0.5 ~ 0.8 μmol·L-1時，條帶較多(圖6泳道5 ~ 8)，但各條帶亮度不一。本研究正交試驗所設置的4個引物濃度為0.5、0.6、0.7、0.8 μmol·L-1。

圖6 引物濃度的影響

注：M泳道為Maker DL3000，1 ~ 8泳道的用量分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol·L-1

2.3 ISSR-PCR熱循環的反應參數

2.3.1 循環次數對ISSR-PCR反應的影響

循環次數對PCR擴增產物的產量影響較大，PCR循環次數不足，會引起擴增產物量不足，電泳時部分條帶無法檢測出來；循環次數過多，不僅不能使產量增加，反而引起非特異性擴增，錯配比例升高，發生彌散現象[26]。循環次數梯度試驗結果表明(圖7)，循環次數為20、25次，循環次數過低無法擴增出條帶；設置為30次循環時，擴增產物少，條帶弱；將循環次數提高至35、40次，擴增產物明顯增多，條帶帶型一致，清晰穩定?？紤]到時間影響，最佳的循環次數為35次。

圖7 循環次數的影響

注：M泳道為Maker DL3000，1 ~ 5泳道分別為：20、25、30、35、40循環

2.3.2 退火溫度對ISSR-PCR反應的影響

引物退火溫度主要取決于引物堿基組成、引物濃度、引物與模板的配對程度等，退火溫度低，退火較容易，但特異性低；退火溫度過高，可提高產物特異性，但影響引物與模板的結合程度[24]。退火溫度梯度試驗結果表明(圖8)，溫度為52℃、54℃時，條帶較少；51℃、53℃、55℃時，條帶較豐富，其中51℃時條帶清晰穩定，與53℃、55℃相比弱帶較少，最佳退火溫度為51℃。

圖8 退火溫度的影響

注：M泳道為Maker DL3000，1 ~ 5泳道為51、52、53、54、55℃

2.4 正交試驗結果分析

根據正交試驗擴增產物電泳結果(圖9)，對3次重復試驗分別進行評分(表2)，得出結果值最高為組合4：MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.3 mmol·L-1、DNA聚合酶1.25 U、DNA模板60 ng、引物0.8 μmol·L-1。利用軟件SAS進行方差分析(表3)，結果表明各因素水平間的差異極顯著。由表中值可知，各因素水平的變化對ISSR-PCR影響程度的大小順序為Mg2+＞dNTPs＞DNA模板＞引物＞DNA聚合酶。

圖9 正交試驗電泳圖重復1

注：M為Maker DL3000，泳道1 ~ 16分別為正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析表

對試驗結果進一步做Duncan多重比較(表4)，結果表明：Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1時，結果均值最大，與其他3個水平的差異顯著。結果均值最大的dNTP濃度為0.3 mmol·L-1，與其他3個水平有顯著差異。對DNA用量的比較表明，在一定范圍內高濃度的DNA對擴增效果較好，用量為50 ng、60ng的PCR反應結果均值顯著高于30 ng、40 ng。對引物的比較分析表明，結果均值隨著引物濃度的升高而降低，且0.5 ~ 0.7 μmol·L-1對PCR效果沒有差異。DNA聚合酶用量在0.50 ~ 1.00 U時PCR反應均值差異不顯著。

正交試驗結果值最高的組合中，Mg2+和dNTP濃度對PCR效果顯著優于其他濃度，60 ng的DNA用量其均值雖低于50 ng，但并無差異且顯著優于其他DNA用量，引物濃度和DNA聚合酶對PCR的影響程度最小。組合4可作為粗皮桉的PCR優化體系。

表4 各因素水平的Duncan多重比較

注：各列均值后不同小寫字母表示在0.05水平上的差異。

2.5 結果驗證

用單因素和正交設計雙重試驗最后得到的優化體系對部分粗皮桉DNA樣品進行PCR擴增試驗，以驗證體系的穩定性，試驗結果如圖10。結果表明，通過試驗所得粗皮桉ISSR-PCR反應體系對不同個體的粗皮桉DNA樣品均能擴增出清晰穩定的條帶，穩定性較好，較適用于粗皮桉的ISSR-PCR擴增反應。

圖10 部分粗皮桉DNA樣品PCR擴增結果

3 結論與討論

在ISSR-PCR擴增反應中，反應的各組成成分之間是相互影響的，在對反應體系的優化中，單因素試驗只是改變其中一個因子的濃度，忽略了各因子之間的相互作用。通過單因素試驗篩選出各因子比較適宜的濃度范圍，在此適宜的濃度范圍基礎上進行正交試驗，不僅考慮到了各因素的交互作用，而且避免出現因為因素水平的設計離最佳水平偏差較大而使試驗結果較差的現象。

不同樹種對PCR反應的條件要求不一，試驗所得粗皮桉的ISSR-PCR反應體系與其他樹種的體系有較大的區別，即使與同一科屬的鄧恩桉ISSR-PCR反應體系相比，除Mg2+濃度相同外，其他條件也均不一樣[26]。

本研究利用單因素和正交設計雙重試驗方法得到的粗皮桉ISSR-PCR的優反應體系為：在25 μL反應體系中，10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、DNA聚合酶1.25 U、DNA模板60 ng、引物0.8 μmol·L-1。優化的ISSR-PCR擴增程序為：94℃預變性5 min，然后按94℃變性1 min，53℃退火3 min，72℃延伸2 min，進行35個循環，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

[1] 祁述雄.中國桉樹(第2版)[M].北京:中國林業出版社, 2002.

[2] 佩格 R E,王國祥.粗皮桉家系試驗初報[C]//洪菊生.澳大利亞闊葉樹研究.北京:中國林業出版社,1993.

[3] 廖柏勇,劉麗婷,莫曉勇,等.10年生粗皮桉種源家系選擇分析[J].華南農業大學學報,2011,32(4):72?77,81.

[4] 林玉清.閩南山地粗皮桉家系引種試驗[J].福建林業科技,2010,37(3):50?55.

[5] 陳文平,羅建中,謝耀堅.粗皮桉種源/家系的遺傳變異[J].廣東林業科技,2001,17(3):1?6.

[6] 趙榮軍,張黎,霍小梅,等.基于近紅外光譜技術預測徑/弦切面粗皮桉木材微纖絲角[J].光譜學與光譜分析,2010, 30(9):2355?2359.

[7] 霍小梅.基于近紅外光譜技術預測粗皮桉木材主要物理力學性質的研究[D].北京:中國林業科學研究院,2010.

[8] 趙榮軍,霍小梅,邢新婷,等.粗皮桉木材氣干密度測定方法比較研究[J].西北林學院學報,2010,27(2):242?244.

[9] 趙榮軍,周賢武,任海清,等.粗皮桉生長錐與中心條氣干密度和彈性模量預測及相關性分析[J].東北林業大學學報,2013,41(12):68?71.

[10] 趙榮軍,邢新婷,呂建雄,等.粗皮桉木材力學性質的近紅外光譜方法預測[J].林業科學,2012,48(6):106?111.

[11] 霍小梅,趙榮軍,姚春麗,等.近紅外光譜法預測粗皮桉木材的化學成分質量分數[J].東北林業大學學報,2010,38 (8):78?79,104.

[12] 龍傳文.粗皮桉木材的干燥特性與干燥基準制定[J].中南林業科技大學學報,2012,32(1):48?50.

[13] 張黎.利用近紅外光譜技術預測粗皮桉木材微纖絲角和氣干密度的研究[D].西安:西北農林科技大學,2008.

[14] 趙星,姚春麗,田睿,等.不同種源粗皮桉的化學組成特性研究[J].造紙科學與技術,2009,28(1):6?11.

[15] Luo J Z,Arnold R J,Aken K.Genetic variation in growth and typhoon resistance ininsouth-western China[J].Australian forestry,2006,69(1):38?47.

[16] Zietkiewicz E,Rafalkski A,Labuda D.Genome finger? printing by simple sequence repeat(SSR)—anchored polymerase chain reaction amplication[J].Genomics,1994, 20(2):176?183.

[17] 王建波.ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J].遺傳,2002,24(5):613?616.

[18] 李乃偉,束曉春,何樹蘭,等.南方紅豆杉的ISSR遺傳多樣性分析[J].西北植物學報,2010,30(12):2536?2541.

[19] 楊傳平,魏利,姜靜,等.應用ISSR?PCR對西伯利亞紅松19個種源的遺傳多樣性分析[J].東北林業大學學報, 2005,33(1):1?3.

[20] 宣繼萍,章鎮,房經貴,等.蘋果品種ISSR指紋圖譜構建[J].果樹學報,2002,19(6):421?423.

[21] 繆恒彬,陳發棣,趙宏波,等.應用ISSR對25個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J].中國農業科學, 2008,41(11):3735?3740.

[22] 邱英雄,傅承新,何云芳.樂昌含笑不同類型鑒定的ISSR?PCR分析[J].林業科學,2002,38(6):49?52.

[23] 曾艷玲,謝鵬,謝耀堅,等.桉樹ISSR?PCR反應體系的建立及優化[J].中南林業科技大學學報,2008,28(1):44?48.

[24] 李娟玲,劉國民,曹嵩曉,等.利用單因子和正交設計雙重實驗法優化鷓鴣茶RAPD?PCR反應體系[J].農業學報,2011,1(4):14?21.

[25] 何正文,劉運生,陳立華,等.正交設計直觀分析法優化PCR條件[J].湖南醫科大學學報,1998,23(4):403?404.

[26] 付燕,羅楠,楊岑,等.枇杷屬植物ISSR反應體系的建立和優化[J].果樹學報,2009,26(2):180?185.

Optimization of ISSR-PCR Systems for

CHEN Sheng-kan1,2, XIANG Dong-yun2, DENG Zi-yu2, LIANG Jian-xin3, LAN Bi-bu3,LI Chang-rong2, LIANG Ji1,2

(1.,530004,,; 2.,,530002,,; 3.,542800,,)

In order to develop an optimized ISSR-PCR analytical system for, single factor experiments were conducted to determine suitable concentrations of different factors (Mg2+, dNTP,DNA polymerase, DNA template, primer) that influence ISSR-PCR analyses. Based on the optimal concentrations identified, an orthogonal designed trial was carried out in order to optimize 5 factors at 4 levels. The results showed that a suitable ISSR-PCR reaction system involved: 25 μL reaction system containing 10×PCR buffer 2.5 μL, MgCl22.0 mmol·L-1, dNTPs 0.3 mmol·L-1,DNA polymerase 1.25 U, DNA template 60 ng and primer at 0.8 μmol·L-1. Through gradient testing, the optimized PCR amplification program was determined to involve pre-denaturing at 94℃ for 5 min, then denaturing at 94℃ for 1 min, annealing at 51℃ for 3 min, extension at 72℃ for 2 min over 35 cycles, and finally extension at 72℃ for 5 min. The PCR amplification products were stored at 4℃.

; ISSR-PCR; single factor test; orthogonal experiment

S718.46

A

2015-01-09

廣西優良用材林資源培育重點實驗室開放課題(12A0101); 廣西科學研究與計劃開發項目:桉樹中大徑級鋸材培育與加工利用技術合作研究(桂科合1347004-3)

陳升侃(1989— )，男，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究.E-mail:chenshengkan@126.com

梁機(1961— )，男，博士，主要從事林木遺傳育種研究.E-mail:liangjimail@163.com