弓形蟲病免疫學診斷方法的研究進展

杜夏夏，徐鵬

（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001）

弓形蟲病免疫學診斷方法的研究進展

杜夏夏，徐鵬?

（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001）

弓形蟲病是一種分布廣泛危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，感染后無特征性臨床癥狀，且病原學檢出率低，而免疫學檢測具有敏感、快速、便捷等特點，常用的弓形蟲免疫學診斷方法有ELISA、IHA、MAT等，本文對近年來弓形蟲病免疫學診斷方法的研究進展作以綜述。

弓形蟲??；免疫學；診斷技術

弓形蟲是專性寄生于人與動物有核細胞內的寄生性原蟲，1908年，法國人Nicolle、Manceaux在剛地梳趾鼠的肝脾單核細胞中發現該蟲種，因其滋養體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii），由其引起的疾病稱為弓形蟲病。該病給人畜造成嚴重危害，20世紀70年代豬的無名高熱，其最終禍首就是弓形蟲，豬群患病后表現為高熱稽留（體溫40～42℃）、呼吸困難、咳嗽、腹式呼吸；病豬精神沉郁，結膜發紺，皮膚出現紫紅色淤斑，體表淋巴結特別是腹股溝淋巴結明顯腫大，身體下部及耳部出現淤血斑或出現較大面積發紫，有的出現腸炎及神經癥狀；孕母豬發生早產或產出發育不全的仔豬或死胎。死后剖撿可見肺、肝、脾、淋巴結、心肌、腦等處均有炎性壞死性變化，顯微鏡下可見有多形性的滋養體，有的在心、腦、骨骼肌等處有休止期的包囊。貓作為弓形蟲的終末宿主，感染后大多呈隱性或亞臨床型經過而成為帶蟲者，只有少數出現臨床癥狀。幼齡貓或機體處于應激狀態時，可急性發作，臨床表現為貓的體溫升高，下痢、呼吸困難和肺炎，有的出現神經癥狀。成年貓多為帶蟲者，從糞便排出卵囊，感染其他宿主。

鑒于弓形蟲病大多缺乏特異性臨床癥狀，臨床表現復雜多變，診斷較為困難。而免疫學診斷具有快速、準確、便捷等優點，是目前臨床上常用的輔助診斷方法。弓形蟲病急性期以檢出弓形蟲特異性IgM抗體或弓形蟲循環抗原[1]作為可靠指標，也可觀察特異性IgG抗體的動態變化；慢性期以檢測弓形蟲IgG抗體為主。檢測抗弓形蟲抗體或循環抗原的免疫學診斷方法主要有薩賓-費爾德曼染色試驗（DT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接血凝試驗（IHA）、間接熒光抗體試驗（IFA）、改良凝集實驗（MAT）、免疫膠體金技術等。本文對近年來弓形蟲病免疫學診斷方法的研究進展作以綜述。

1 薩賓-費爾德曼染色試驗（DT）

該方法是弓形蟲病所特有的免疫學診斷方法，其原理是弓形蟲在與陰性血清作用后仍能被堿性美藍染液深染，但與陽性血清（抗體）作用后則不著色或著色很淡。據此便可判斷被檢者血清中是否含有弓形蟲抗體。該法的優點是特異性強敏感性高，感染后數天即可出現這種抗體，可用于早期診斷；缺點是所用抗原為活蟲，安全性差，輔助因子較難獲得，因此我國很少使用。

2 凝集試驗

2.1 直接凝集試驗（DTA）該方法的特點是簡便快速，陽性反應出現時間比間接血細胞凝集試驗（IHA）早。試驗以甲醛固定的弓形蟲懸液作為抗原與被檢血清直接進行反應。在玻片上加不同稀釋度的試驗血清，混勻，幾分鐘后在顯微鏡下觀察，如發生凝集，則為陽性反應。

2.2 改良凝集試驗（MAT）在直接凝集試驗基礎上經美國學者Dubey等的改良和發展，顯著提高了檢測結果的敏感性和特異性，并將其稱為改良凝集試驗。該方法基本原理是將待檢血清中的弓形蟲特異性IgG抗體與速殖子表面抗原發生交聯反應，通過伊文思藍染色，在反應孔底部形成放大鏡下可見的蟲體抗原積層。至今，這種檢測方法仍在歐美各國廣泛用于人和動物弓形蟲病的篩查，Dubey將幾種免疫診斷技術比較后認為MAT是弓形蟲抗體檢測的金標準。

2.3 間接血細胞凝集試驗（IHA）由于抗原與相應抗體結合而使載體顆粒發生凝集，稱間接凝集，又稱被動凝集。紅細胞作為一種常見的抗原載體，用紅細胞作為抗原載體的凝集反應稱為間接血凝試驗。反應原理是：將可溶性抗原致敏于紅細胞表面，用以檢測相應抗體，在與相應抗體反應時出現肉眼可見凝集。其臨床意義在于弓形蟲病的IHA一般在病后1個月左右出現陽性。血清抗體效價1:64為既往感染，1:256可能為近期感染，1:1 024為急性感染。IHA操作簡單，敏感性高，適用于現場檢測，可作為輔助診斷以及流行病學調查，缺點是重復性差，致敏紅細胞不穩定。

3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯免疫吸附試驗是20世紀70年代后期出現的一種標記免疫測定技術，經過不斷的改進和完善，該法已成為十分成熟的免疫學診斷方法。它具有高度的敏感性和特異性，操作簡便，不需特殊儀器設備，血樣用量少，判斷結果容易，現場應用方便，是目前符合現場需要的較好的免疫診斷方法。

現目前已開發出大量的弓形蟲病ELISA診斷試劑盒，主要檢測循環抗原（CAg）和特異性抗體（IgG、IgM），CAg比特異性抗體出現得更早，因此作為弓形蟲感染的早期檢測指標。特異性抗體的檢測：弓形蟲感染后，血液內最早出現的抗體是IgM，可在弓形蟲感染后持續存在數周，因此IgM的檢測可作為弓形蟲病的早期診斷。而IgG在感染7 d后出現，但可存在較長時間。但由于IgG在感染者體內含量較高，因此易出現假陽性。因此多采用兩種方法相結合的方式來提高檢測的準確性。

3.1 斑點ELISA斑點ELISA（Dot-ELISA）比常規ELISA更靈敏、便捷、取材量少，因而迅速被推廣應用，在1986年國外已應用于弓形蟲病診斷。

3.2 PCR-ELISA 李健等[2]將生物素標記的PCR產物與地高辛標記的特異性探針雜交，再通過酶聯顯色反應測出OD值，以判斷弓形蟲感染情況，用該方法檢測以104、103弓形蟲RH株速殖子腹腔接種小鼠的全血、肝組織，結果PCR-ELISA方法的檢測閾值為20 fg，其靈敏度是常規PCR的10倍，并且與人、小鼠瘧原蟲、旋毛蟲等DNA均無交叉反應，同一樣本重復測試5次，一致性良好，檢測感染動物的肝組織及全血標本，104、103組分別在感染后第2天、第3天即可測出陽性，兩種標本的陽性檢出率無統計學差異，因此PCR-ELISA是一種快速、高效的測定方法，可應用于臨床弓形蟲病的診斷及流行病學調查等。

4 免疫膠體金技術（ICG）

目前，利用膠體金標記技術診斷弓形蟲病的方法有免疫金銀染色法（IGSS）、快速斑點免疫金滲透法（DIGFA）和膠體金免疫層析法（GICA）。

4.1 免疫金銀染色法（IGSS）免疫膠體金染色法是一種較新的免疫診斷方法，其原理是膠體金探針與相應抗原或抗體形成抗原抗體復合物，經過銀顯影處理后，使金顆粒周圍吸附大量銀顆粒。由于銀染色對金顆粒之信號有放大作用，所以敏感度很高。

4.2 快速斑點免疫金滲透法（DIGFA）應用硝酸纖維素膜（NC膜）作載體的免疫檢測技術。先將抗原或抗體點于NC膜上，封閉后加待測樣品，洗滌后用膠體金探針檢測相應的抗原或抗體，通過金顆粒放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體NC膜上顯示。并將其裝入充滿吸水材料的滲濾裝置中，裝置分為底和蓋，蓋上一般有直徑為0.5～0.8 cm的小孔。研究表明，該方法特別適合用于間接法檢測抗體或捕獲法檢測IgG。黃菱等[3]建立了便捷、快速的斑點金免疫滲透法檢測腫瘤病患者血清弓形蟲IgG抗體，通過膠體金-SPA直接顯色，陽性者出現紅色斑點。用該法對232名腫瘤病患者血清和260名正常體檢者血清進行檢測，與IHA法對比檢測，其結果具有良好的一致性。

4.3 膠體金免疫層析法免疫層析技術是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術、層析分析技術、單克隆抗體技術和新材料技術等多種方法有機結合的一種新型診斷技術。李昕等[4]用膠體金標記弓形蟲單克隆抗體，制成檢測宿主血清中的弓形蟲循環抗原的膠體金免疫層析試劑條，用其檢測了75份感染弓形蟲速殖子后不同時間小鼠血清中的CAg及30份正常小鼠血清中的抗原，并與ELISA夾心法進行比較。兩種方法檢測高免弓形蟲循環抗原的符合率為95%，膠體金免疫層析試劑條的靈敏度和ELISA相近。王艷華等[5]利用膠體金標記弓形蟲代謝分泌抗原，利用雙抗原夾心法研制出了弓形蟲抗體金標檢測試劑條，在對弓形蟲陰、陽性血清檢測中，與弓形蟲IHA檢測結果符合率為82.4%，其中弓形蟲IHA檢測陽性的血清金標試劑條全部為陽性，用金標試劑條檢測人工感染弓形蟲的兔血清，感染后第3天即可檢測到抗體，而用間接血凝診斷試劑檢測，感染后第5天才能檢測到抗體，前者較后者提前2天檢測到抗體。該試劑條法靈敏度明顯高于IHA法，同時具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩定性，適用于弓形蟲病早期檢測和診斷，特別適合在基層推廣應用。

為探討3種方法檢測弓形蟲IgG抗體的測試效率，楊亞曉等[6]通過使用金標記、間接血凝試驗（IHA）和酶聯免疫吸附（ELISA）的方法檢測全部304個標本的弓形蟲IgG抗體，并對其敏感性、特異性和約登指數進行了比較。金標記檢測標法、間接血凝試驗（IHA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測弓形蟲IgG抗體的敏感性分別為85.5%、89.8%和91.9%；特異性分別為92.4%、96.6%和97.5%。酶聯免疫吸附試驗的檢測效率和約登指數分別94.1%和89%，高于間接血凝試驗（IHA）和金標記的方法。它檢測弓形蟲IgG抗體的敏感性和特異性較高，另外，它可以實現自動化，因此，是適合大型弓形蟲IgG抗體篩查方法。

Khanaliha K1等[7]對基因重組抗原（SAG1、SAG2和SAG3）的診斷作用進行評價，并提供商業酶聯免疫吸附法比較其功效。運用重組質粒轉化到JM109菌株的致病性大腸桿菌，并進行表達和純化。SAG1、SAG2和SAG3抗原使用酶聯免疫吸附試驗系統中不同組的血清和結果對照那些商業的IgG和IgM酶聯免疫吸附試劑盒。重組表面抗原的抗弓形蟲IgG與商用酶聯免疫吸附試驗敏感性和特異性檢測結果如下：SAG1（93.6%和92.9%），SAG2（100.0%和89.4%）和SAG3（95.4%和91.2%），重組SAG2與商業酶聯免疫吸附試驗檢測抗弓形蟲IgG抗體沒有觀察到高度的一致（96.9%）。P22有檢測抗弓形蟲IgM與其他2基因重組抗原的最佳表現。重組SAG1、SAG2和SAG3可全部用于T抗體特異性抗體診斷弓形蟲。并得到ELISA檢測法具有特異性強、靈敏度高等特點。Shirbazou等[8]通過病例對照研究，考察了整體184份血清樣品，包括91例糖尿病和93例非糖尿病患者的健康對照。血清樣本作糖的酶法和酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測抗弓形蟲IgG抗體株，得到糖尿病患者和健康對照組弓形蟲IgG抗體的患病率分別為60.43%和38%。糖尿病患者弓形蟲感染的風險是健康對照組兩倍高。感染艾滋病毒的患者感染弓形蟲可導致致命的腦炎。診斷主要依靠示范寄生蟲特異性抗體的血清。但艾滋病毒感染者,IgM經常檢測不到，然而IgG仍然是探測在大多數。尿液樣本很容易獲得。Bhattacharyya等[9]研究觀察到艾滋病毒感染患者血清和尿液樣本中的抗弓形蟲IgM和IgG之間無顯著性差異。因此，尿液樣本可代替血清進行弓形蟲病的免疫診斷的研究。

5 展望

弓形蟲病在免疫學診斷技術研究方面取得了較大進展，一些研究成果已經或正在對弓形蟲病的防控產生重大作用。但目前弓形蟲病免疫學診斷方面仍然存在一些問題，上述幾種免疫學檢測方法的敏感性、特異性都有不同的閾值，還有一定的局限性；用于診斷的抗原或抗體純度不夠；很多技術方法還不夠成熟，只停留在試驗階段，未投入實踐應用；目前用于弓形蟲快速檢測的診斷試劑盒數量少質量較差等。綜上所述，開發新的弓形蟲病診斷方法，把現有的經典的免疫學診斷方法進一步優化，這將是未來一段時間研究的方向。目前可根據現有的診斷資源，選擇多種診斷方法相結合來提高診斷的特異性和敏感性，從而達到早診斷早確診早治療的目的，把弓形蟲病患病風險及危害降到最低。

[1]Wang Y1,Yin H.Research progress on surface antigen1(SAG1)oftoxoplasmagondii[J]. Parasit Vectors,2014,7:180.

[2]李健，楊秀珍，梁東春，等.PCR-ELISA檢測弓形蟲實驗研究［J］.中國人獸共患病學報，2006，22（4）：356-359.

[3]黃菱，李熊兵，趙瑞，等.斑點金免疫滲濾法檢測腫瘤患者血清弓形蟲IgG抗體的應用研究[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2005，12（1）：17-19.

[4]李昕，邸寶華，李會強，等.膠體金免疫層析法檢測弓形蟲循環抗原的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2006，16（2）：149-151.

[5]王艷華，李克先，才學鵬，等.弓形蟲抗體免疫膠體金快速檢測試紙條的研制[J].中國獸醫科學，2007，37（1），29-32.

[6]楊亞曉，陳玉昆，魏世錦，等.三種方法檢測弓形蟲IgG抗體的效能[J].中國血吸蟲病防治雜志，2014，26（1）：109-110.

[7]Khanaliha K,Motazedian MH.Evaluation of recombinant SAG1,SAG2,and SAG3 antigens for serodiagnosis of toxoplasmosis[J].Korean J Parasitol,2014,52(2):137-142.

[8]Shirbazou S,Delpisheh A.Serologic detection of Anti toxoplasma gondii Infection in Diabetic Patients[J].Iran Red Crescent Med J, 2013,15(8):701-703.

[9]Bhattacharyya S,Khurana S.Anti-toxoplasma gondii antibody detection in serum and urine samples by enzyme-linked immunosorbent assay in HIV-infected patients[J].Indian J Pathol Microbiol,2013,56(1):20-23.

（編輯：張婷婷）

Research progress on immunological diagnosis of Toxoplasma gondii

Du Xiaxia,Xu Peng*

（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

Toxoplasmosis is a widespread serious zoonotic disease withno clinical symptoms after infection,and the low etiology detection rate.Immunological detection possess a sensitive,rapid,and convenient features.Commonly used immunological diagnostic methods include ELISA,IHA, MAT,etc.This papersummarized the recent studies on toxoplasmosis immunological diagnostic methods for reviewed.

Toxoplasmosis;Immunology;Diagnostic techniques

S852.62文獻標識碼：A文章編號：1672-9692(2015)02-0055-04

2015-01-11

杜夏夏（1993-），女，在讀本科生，動物醫學專業。

徐鵬（1979-），男，講師，主要從事動物寄生蟲病、人畜共患病教學科研工作。

遼寧省大學生創新訓練項目（編號201410160019），遼寧省自然科學基金（編號2014022053）