海洋紅酵母的發酵條件

郭 馨 澤，劉 彤，黃 忠 剛，葉 淑 紅，肖 珊，王 晗，王 際 輝

（1.大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連市水產技術推廣總站，遼寧 大連 116023；3.大連博仕奧生物科技有限公司，遼寧 大連 116085）

0 引 言

海洋紅酵母菌體中富含蛋白質、糖類、維生素、消化酶及生長因子等多種生理活性物質，因此能有效地促進水產動物個體生長，并能提高水產動物的存活率、增強繁殖能力。趙昌會等［1］的研究結果表明，海洋紅酵母菌體中含有大量的蛋白質和促進生長因子，在水產養殖業中，通常作為水產動物育苗的開口餌料，用于促進水產動物生長［2－4］。海洋紅酵母菌體中含有的蝦青素在抗氧化、消除自由基方面的功能很強，可以促進抗體的產生并增強動物的免疫功能［5］。海洋紅酵母可以抑制海洋中的病原微生物［6］，還可以用作水質調節劑［7－10］。作者對海洋紅酵母搖瓶培養條件進行了優化，旨在提高海洋紅酵母的發酵產量，為大規模發酵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

海洋紅酵母菌株，由大連工業大學食品學院發酵工程實驗室從海泥中分離、鑒定并保存，命名為003。

1.1.2 培養基

各種培養基經過121 ℃、20 min 高壓滅菌，冷卻至常溫備用。

斜面活化培養基：葡萄糖1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，瓊脂2.0%，蒸餾水100mL，自然pH。

液體種子培養基：葡萄糖2%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.15%，蒸餾水100mL，自然pH。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.15%，蒸餾水100 mL，自然pH。

1.2 方 法

1.2.1 菌株擴大培養

斜面活化：將冰箱內保存的菌種接種到斜面培養基上活化，22 ℃恒溫培養24h。

種子培養：斜面培養基22 ℃培養24h后，從斜面接種1環到裝液量250mL瓶裝50mL的培養基中，于22 ℃、200r／min條件下培養24h。

發酵培養：以5%的接種量將種子液接入發酵培養基中，裝液量為250mL瓶裝50mL，搖床轉速200r／min，于22 ℃培養24h。

1.2.2 單因素試驗

分別比較時間、溫度、無機鹽、pH 等不同培養條件下海洋紅酵母菌產量，確定最佳單因素條件。

1.2.3 正交試驗

采用四因素三水平L9（34）正交試驗，共設9個處理，每個處理3 個重復，各因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 發酵罐擴大培養

在發酵培養基及培養條件優化的基礎上，進行海洋紅酵母菌株5L發酵罐擴大培養試驗。試驗裝料系數為70%，優化培養基滅菌后，以8%的接種量接入海洋紅酵母菌株，培養溫度22 ℃，初始pH 4.8，攪拌速度280～350r／min，通氣量6L／min。每隔3h無菌采樣測定菌量。

1.2.5 酵母細胞數測定方法

血球計數板法［11］。

2 結果與分析

2.1 培養基的優化

2.1.1 酵母菌的生長曲線

發酵培養后，從3h開始，每隔3h取樣，進行菌量的測定。依據菌量數據繪制該菌株的生長曲線，如圖1所示。

圖1 海洋紅酵母生長曲線Fig.1 Marine red yeast growth curve

發酵過程菌的生長：在9～24h菌呈對數生長；24～42h產量基本不變，為生長穩定期，產量最高達9.72×108cfu／mL；42h后進入衰亡期，所以在后續搖瓶試驗中，發酵時間可采用24h。

2.1.2 碳源對海洋紅酵母菌量的影響

2.1.2.1 碳源種類對海洋紅酵母產量的影響

選取質量分數為1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉來研究不同碳源對海洋紅酵母產量的影響，結果如圖2所示。從圖中可以得出，以葡萄糖作為碳源效果最好，蔗糖次之。葡萄糖來源廣泛，價格低廉，綜合考慮，選擇葡萄糖作為海洋紅酵母的最佳碳源。

圖2 碳源種類對海洋紅酵母菌量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on biomassof marine red yeast

2.1.2.2 碳源濃度對海洋紅酵母產量的影響

以葡萄糖作為碳源，考察不同濃度對海洋紅酵母發酵產量的影響，結果如圖3 所示。在0～1%，隨著葡萄糖質量分數的增大，菌量增多；在1%～2%菌量較高；當質量分數大于2%時，菌量逐漸下降。通過試驗得知，1%時酵母菌產量相對較高，與2%時的產量差別不大。綜合考慮，選葡萄糖的質量分數為1%，此時海洋紅酵母產量為7.92×108cfu／mL。

圖3 葡萄糖質量分數對海洋紅酵母菌量的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on biomass of marine red yeast

2.1.3 氮源對海洋紅酵母酵母產量的影響

選擇蛋白胨、玉米粉、硫酸銨及其組合作為不同的氮源，同時用酵母膏作為輔助氮源來考察氮源對海洋紅酵母產量的影響。結果如圖4所示，海洋紅酵母利用不同氮源發酵的菌體生物量依次為：蛋白胨＋玉米粉＋酵母膏＞蛋白胨＋硫酸銨＋酵母膏＞蛋白胨＋酵母膏＞硫酸銨＋酵母膏＞玉米粉＋硫酸銨＋酵母膏＞玉米粉＋酵母膏。由于蛋白胨＋玉米粉＋酵母膏組合氮源的海洋紅酵母產量最高，而且玉米粉的成本較低，因此選擇玉米粉、蛋白胨和酵母膏作為氮源。

2.1.4 無機鹽對海洋紅酵母產量的影響

2.1.4.1 無機鹽種類對海洋紅酵母產量的影響

選取0.5%的磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣和氯化鈉這幾種無機鹽來研究不同無機鹽對海洋紅酵母產量的影響，結果如圖5所示。從圖中可以看出，相同濃度下以氯化鈉為無機鹽效果最好，硫酸鎂次之。氯化鈉來源廣泛、價格低廉，綜合考慮，選擇氯化鈉作為海洋紅酵母的最佳無機鹽。

圖4 氮源對海洋紅酵母菌量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on biomass of marine red yeast

圖5 無機鹽對海洋紅酵母產量的影響Fig.5 Effect of inorganic salts on biomass of marine red yeast

2.1.4.2 無機鹽濃度對海洋紅酵母菌量的影響

以氯化鈉作無機鹽，考察不同的無機鹽濃度對海洋紅酵母發酵產量的影響，結果如圖6所示。隨著無機鹽濃度的增加，酵母菌產量有起伏。當鹽質量分數在0～1%增加時，菌量隨之增加，說明在此鹽濃度范圍內，鹽濃度增加促進了海洋紅酵母的生長速度；當鹽質量分數在1%～3%時，隨鹽濃度的增加其生長速度隨之減慢，說明高鹽濃度抑制了細胞生長。當氯化鈉質量分數為1%時產量最高，產量為8.06×108cfu／mL。

2.1.5 正交試驗

通過單因素試驗確定了培養基的最佳參數，通過考察葡萄糖、酵母膏、蛋白胨以及玉米粉質量分數這4個因素的相互影響，以海洋紅酵母產量為考察指標，得到的正交試驗結果如表2 所示。由表2可知，各種因素對海洋紅酵母影響程度為：葡萄糖＞酵母膏＞蛋白胨＞玉米粉。葡萄糖對菌量的增加作用最顯著，其次是酵母膏，再次是蛋白胨，最后是玉米粉。通過正交試驗優化，得到海洋紅酵母最優培養基為：葡萄糖1.0%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.4%、玉米粉0.1%。

圖6 NaCl質量分數對海洋紅酵母產量的影響Fig.6 Effect of NaCl on biomass of marine red yeast

表2 正交試驗結果分析Tab.2 Results of analysis of orthogonal test

2.2 培養條件的影響

2.2.1 pH 對海洋紅酵母產量的影響

選擇優化后的發酵培養基（pH 4.8～6.0），以確定最適的pH，結果如表3所示。pH 為4.8，即自然值時酵母菌達到最大產量。這可能由于低pH 可抑制雜菌，減少污染，所以實際生產中，要將海洋紅酵母的發酵培養基的pH 控制在4.8，這樣既可提高菌量，又在一定程度上控制污染。

2.2.2 溫度對海洋紅酵母產量的影響

選擇18、22、26、30 ℃進行試驗，結果如表4所示。在18～22℃，隨著溫度的升高，菌量增多；其中，在22和26 ℃時，菌量較高，且菌數比較接近，但從節能角度考慮，選擇22 ℃進行培養。

表3 pH 對海洋紅酵母產量的影響Tab.3 Effect of pH on biomass of marine red yeast

表4 溫度對海洋紅酵母菌量的影響Tab.4 Effect of temperature on biomass of marine red yeast

2.2.3 搖床轉速對海洋紅酵母產量的影響

選擇搖床轉速為160、180、200、220r／min進行試驗，結果如表5 所示。實驗結果表明，在180～200r／min 隨著搖床轉速升高，溶氧量增多，在一定程度上更有利于菌株的生長；但當轉速達到220r／min后，酵母菌產量反而降低。其中，搖床轉速200r／min時的菌數最高，因此選擇搖床轉速200r／min進行培養。

表5 搖床轉速對海洋紅酵母產量的影響Tab.5 Effect of shaking speed on biomass of marine red yeast

2.2.4 裝液量對海洋紅酵母產量的影響

為了考察搖瓶裝液量對菌體產量的影響，選擇250mL 瓶裝10～70mL 的菌液進行試驗，結果如表6所示。結果表明，當裝液量為10mL 時菌數最高，但不適用于實際發酵；當裝液量達到70mL 時，酵母菌生長受到顯著抑制。綜合考慮選擇相對較優的裝液量50mL。

表6 裝液量對海洋紅酵母產量的影響Tab.6 Effect of volume on biomass of Marine red yeast

2.2.5 接種量對海洋紅酵母產量的影響

考察接種量對于海洋紅酵母產量的影響，結果如表7所示。當接種量為8%時，海洋紅酵母產量最大。這是由于較小接種量可能使培養基營養物質不能被充分利用；而接種量過大可能會帶入過多的代謝廢物而不利于菌體生長。

表7 接種量對海洋紅酵母菌量的影響Tab.7 Effect of inoculation quantity on biomass of marine red yeast

通過對海洋紅酵母003發酵條件的單因素試驗，得到其最優培養條件為接種量8%，初始pH 4.8，搖瓶裝液量50mL／250mL，培養溫度22 ℃，搖床轉速為200r／min。菌株在此條件下經24h的培養，菌數可達到1.02×109cfu／mL。

2.3 發酵罐擴大試驗

采用優化的培養基，以8%的接種量接入5L全自動發酵罐，初始pH 控制在4.8，攪拌速率為280～350r／min，通氣量為6 L／min，溫度為22℃，罐壓為0.05 MPa。每隔3h進行采樣，并對菌量進行測定，結果如圖7所示。

圖7 5L發酵罐發酵生長曲線Fig.7 5Lfermentor growth curve

在發酵過程中，酵母菌在8～18h呈對數生長；18～28h產量基本不變，為生長穩定期，產量最高達1.05×109個／mL；28h后進入衰退期（圖7）。根據試驗結果，在后續發酵罐試驗中可選取18h作為發酵時間，以節省生產成本。

3 結 論

對一株來自海洋泥土中的紅酵母003進行了培養條件的優化。發酵培養基的確定：葡萄糖是更適于酵母菌生長的碳源，葡萄糖最佳質量分數為1.0%；以蛋白胨、玉米粉和酵母膏混合氮源對海洋紅酵母的生長最有利；NaCl是海洋紅酵母生長的最佳無機鹽，當其質量分數為1.0%時海洋紅酵母產量最高。以葡萄糖、蛋白胨、玉米粉、酵母膏為主要因素，進行正交試驗，最優結果為葡萄糖1.0%，蛋白胨0.4%，玉米粉0.1%，酵母膏0.5%。發酵條件的優化：通過對海洋紅酵母003生長條件的研究，確定了其在pH 為自然值、發酵溫度22 ℃、接種量8%、裝液量為250 mL 瓶裝50mL發酵液、轉速200r／min時，酵母產量最高可達1.02×109cfu／mL，在此條件下海洋紅酵母003生長最好。

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