PCR－焦磷酸測序法快速鑒定食品中腸炎沙門菌

曹 冬 梅，倪 長 鵬，劉 宇，盧 熠 川，許 龍 巖，曹 際 娟

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2.大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；3.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623）

0 引 言

沙門菌屬菌型甚多，目前在全世界范圍內已發現2 500余種血清型，我國也有292種被檢出的報道［1］。腸炎沙門菌（SalmonellaEnteritidis，SE）是腸道沙門菌的一種主要血清型，由于其致病性強、感染對象廣泛等特點，引起了各國學者的廣泛關注［2－5］。1996年，我國向歐洲出口的兔肉中檢測出了腸炎沙氏菌，直接導致損失3 000多萬元［2］。2010年，美國加利福尼亞州腸炎沙門菌疫情肆虐，染病人數多達數百人，引發疫情的“問題蛋”召回數量達到5億枚，造成了嚴重的經濟損失。目前，腸炎沙門菌最主要檢測手段仍是生化鑒定配合血清分型，但檢測周期過長，不利于疾控預防與病情診斷。榮策等［6］建立Taqman探針實時熒光PCR 檢測食品中腸炎沙氏菌的方法。田會方等［7］采用PCR－焦磷酸測序技術在沙門菌食物中毒中進行了應用檢測，但不能鑒定血清型。

焦磷酸測序（pyrosequencing）是一種新的序列分析技術，其特點是操作簡便、大通量、自動化，適合大量樣本的快速檢測，無須進行電泳、序列無須熒光標記等，是一個理想的遺傳分析技術平臺［8－9］。因而廣泛應用于基因表達［10］、病毒檢測［11］、SNP分析［12］等多個領域。本研究基于PCR－焦磷酸測序技術，建立快速檢測腸炎沙門菌的方法加以應用。對于方法的特異性、準確性以及與傳統鑒定相符性進行分析，旨在所建立的方法能在食物中毒快速診斷和食品安全領域快速鑒定腸炎沙門菌中得以應用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

腸炎沙門菌標準菌株1 株，臨床分離株13株。陰性對照菌株為鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等8 株標準菌株，以及22株其他血清型的沙門菌分離株（本實驗室留存），所有菌株信息見表1。所有菌株均經過VITEK2、API試劑條和血清學鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑

PCR 擴增儀（PE 9700）；定量遺傳分析系統，Biotage Company；核酸提取儀，Precision System Science（Japan）；PCR 混合緩沖劑、Taq DNA 聚合酶、MgCl2、100bp DNA Marker、瓊脂糖，寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖珠，GE Healthcare（UK）；酶、dNTP、結合緩沖液、退火緩沖液、變性緩沖液、洗滌緩沖液，QIAGEN（中國）；緩沖蛋白胨水（BPW）、連四硫酸鹽肉湯（TTB），北京陸橋公司。

表1 菌株信息表Tab.1 The list of strains

1.2 方 法

1.2.1 引物設計

根據 GenBank 公布的腸炎沙門菌（AF370707.1）序列的保守區域，采用PyroMark Assay Design 2.0設計擴增引物與測序引物（表2），擴增片段大小為176bp。在反向引物5′端標記生物素。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表2 腸炎沙門菌PCR 擴增引物和測序引物Tab.2 The amplification primers and sequencing primers of Salmonella Enteritidis

1.2.2 模板制備

沙門菌菌株于BPW 37 ℃培養10 h，取10mL接種于TTB增菌液，44.5 ℃培養18h，取1mL菌懸液移入離心管，12 000r／min離 心5min去上清，用1 mL 去離子水漂浮沉淀，12 000r／min離心3min去上清，重復2次，最后加200μL去離子水，在核酸提取儀上提取DNA，用于PCR 擴增。

1.2.3 PCR 擴 增

擴增體系為50μL，混合緩沖劑25μL，Taq DNA 聚合酶5μL，MgCl21μL，SEF／SER 引物（10μmol／L）各2μL，模板1μL，去離子水14μL。循環參數為預變性95 ℃5min、95 ℃15s、65 ℃30s、72 ℃30s，45個循環，72 ℃12min，4 ℃保存。PCR 產物一部分進行2%瓊脂糖凝膠電泳，另一部分用于焦磷酸測序。

1.2.4 單鏈模板制備及焦磷酸測序

將15μL 的PCR 產物轉移至96孔PCR 板中，加入2μL 瓊脂糖珠，20μL 結合緩沖液和43μL純水，常溫振蕩混合20 min；打開真空泵，利用高純水清洗準備工具30s并轉移至96 孔板，用于抓取瓊脂糖珠；完畢后將攜有瓊脂糖珠的準備工具放入70%乙醇中5s，再分別在變性緩沖液和洗滌液中各清洗20～30s；準備工具放在裝有退火預混液PSQ 96 板上（預先加入43μL退火緩沖液和2μL測序引物），關掉真空泵，輕輕搖動并釋放磁珠；在80 ℃將PSQ 96 板保溫5min，自然冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。測序程序采用SQA 模式，按ATCG 的堿基排列順序，依次循環加入15次，根據軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PSQ 96孔板和試劑倉放入定量遺傳分析系統中進行焦磷酸測序。測序峰及相應的DNA 堿基序列由儀器SQA 軟件自動分析產生。

1.2.5 與傳統生化鑒定方法的比對驗證

分別稱取25g豬肉和蝦（無沙門菌污染）為基質樣品，每份樣品中加入225 mL 緩沖蛋白胨水，接種腸炎沙門菌 ATCC13076 菌懸液（102cfu／mL），制備2 份模擬樣品。用拍打器拍打20min，37 ℃培養10h。分別取10mL 增菌液移入90 mL TTB 增菌液，44.5 ℃培養18h。然后，取一部分提取DNA 進行PCR－焦磷酸測序，另一部分按照GB 4789.4—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門菌檢驗》進行驗證檢驗。同時，對日常進出口的食品樣品也采用上述兩種方法檢測腸炎沙門菌，并進行比對驗證。

2 結果與分析

2.1 PCR 特異性擴增結果

采用SEF／SER 引物進行PCR 擴增和電泳檢測，結果如圖1 所示。腸炎沙門菌標準菌株ATCC14028及15株分離株（SE1～SE15）均擴增出176 bp 的DNA 片段；而鼠傷寒沙門菌ATCC14028、22株其他血清型沙門菌以及大腸埃希氏菌等陰性對照菌株均未見擴增條帶。結果表明，本實驗設計的腸炎沙門菌PCR 擴增引物具有較好的特異性。

圖1 PCR 特異性擴增腸炎沙門菌的電泳圖Fig.1 PCR result of Salmonella Enteritidis

2.2 焦磷酸測序結果

對PCR 擴增產物進行焦磷酸測序，結果如表3和圖2 所示。14 株腸炎沙門菌（SE1～SE13、SE ATCC14028）分別測出39～43nt的DNA 序列。將這些序列進行BLAST 比對，發現與Genbank中腸炎沙門菌的核苷酸序列呈100%匹配。其他菌株未出現PCR 擴增產物的電泳條帶，因而均無測序結果。結果表明，焦磷酸測序法可以對腸炎沙門菌進行準確鑒定。

表3 14株腸炎沙門菌的焦磷酸測序結果Tab.3 Pyrosequencing results of 14 Salmonella Enteritidis strains

圖2 腸炎沙門菌ATCC13076 的焦磷酸測序圖譜Fig.2 Pyrosequencing map of Salmonella Enteritidis ATCC13076

2.3 比對驗證結果

對2份模擬樣品進行PCR－焦磷酸測序檢測，均檢測出與預期相符的腸炎沙門菌的DNA堿基序列，即CCTGTTGTCT GCTCACCATT CGCCAGCCAC。同時，將模擬樣品按照GB 4789.4—2010進行檢測，均分離鑒定出與添加菌株相一致的腸炎沙門菌。

采用本方法共檢測了360份實際進出口食品樣品，在凍雞和雞屁股2份樣品中檢測出腸炎沙門菌陽性。同時，此樣品也采用經典的培養和生化鑒定方法進行檢測，結果符合率為100%。結果表明，本實驗建立的焦磷酸測序方法與傳統生化鑒定檢測的結果相一致，應用PCR－焦磷酸測序方法檢測腸炎沙門菌具有較好的應用效果。

3 討 論

國內外針對食源性致病菌的快速檢測技術進行了廣泛的研究，研究較多的快速檢測技術是基于實時熒光PCR 方法［13－14］，該方法簡便、實用，但存在著假陽性的可能性。近幾年發展了更為快速的MALDI－TOF－MS檢測技術［15］，該方法鑒定準確，但需要建立在量數據庫的基礎上才能實現鑒定。也有報道采用細菌16SrDNA 基因文庫的構建和分析技術［16］，探討細菌的多樣性的研究。由此可見，各種檢測技術都有不同的優勢和不足。

焦磷酸測序是一種非常具有潛力的DNA 測序技術，有著廣闊的應用領域。在短片段測序的應用中，可能會代替Sanger 末端終止法［17］。2005年，Balitzki－Korte等［18］利用焦磷酸測序技術對人、牛、羊、雞等動物的線粒體12SrRNA 基因進行了檢測。同年，Allen M 等［19］利用焦磷酸測序技術對mtDNA 進行了檢測，驗證了該技術準確、靈敏度好。國內在此方面也有深入的研究。盧熠川等［20］利用焦磷酸測序方法檢測食品中腸道沙門氏菌，但只是停留在種的水平上。曹冬梅等［21］利用焦磷酸測序技術檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌，解決了沙門菌種以下水平的血清型的鑒定問題。

本實驗根據腸炎沙門菌的特異序列，分別設計擴增引物和測序引物，建立了PCR－焦磷酸測序快速鑒定腸炎沙門菌的方法。通過模擬樣品和實際樣品的檢測，證明了PCR－焦磷酸測序快速鑒定方法與傳統檢測方法的一致性。與傳統的鑒定方法相比，PCR－焦磷酸測序法縮短了檢測時間，整個實驗可以在31h 內完成。此外，PCR－焦磷酸測序法可以獲得DNA 堿基序列，準確性更高，在食品安全快速鑒定、食物中毒快速診斷及醫學生物等領域擁有著很好的應用前景。

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