基于GABA A受體評估雙氟沙星對異育銀鯽的安全性

趙依妮孫 琪,胡 鯤楊先樂阮記明周愛玲

(1. 上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 上海黛龍生物科技工程有限公司, 上海 201306)

基于GABA A受體評估雙氟沙星對異育銀鯽的安全性

趙依妮1孫 琪1,2胡 鯤1楊先樂1阮記明1周愛玲1

(1. 上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 上海黛龍生物科技工程有限公司, 上海 201306)

神經傳遞的興奮和抑制的相互平衡是維持中樞神經系統正常功能的必要條件, 其中抑制性則是由最重要的神經遞質γ-氨基丁酸 (GABA) 調節的, 而GABA則主要通過GABA A受體GABAAR起作用。A型受體是一種跨膜門控氯離子通道, 可介導階段性的抑制突觸傳遞, 也可強直性抑制外周突觸傳遞, 因此在神經性疾病如焦慮和癲癇的病理生理學中起著至關重要的作用[1]。刺激GABA的分泌, 增加其與GABA A受體的結合將抑制中樞神經系統興奮, 導致抑郁等消極情緒的產生; 相反, 抑制GABA的分泌, 減少其與GABA A受體的結合可刺激中樞神經興奮, 導致癲癇等疾病的產生[2]。喹諾酮類藥物是人工合成的含 4-喹諾酮基本結構的抗菌藥物, 其抑菌機理主要是對細菌DNA回旋酶 (DNA gyrase) 具有選擇性抑制作用[3]。喹諾酮類藥物分為四代, 目前臨床應用較多的為第三代喹諾酮類藥物, 水產養殖業中常用的有雙氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星等。其中, 雙氟沙星 (Difloxacin, DIF) 抗菌活性高, 對革蘭氏陽性和陰性菌及多種厭氧菌都有較強的抗菌作用[4], 且雙氟沙星質量穩定、口服吸收性好、體內濃度高、半衰期長且與其他抗菌藥物無交叉耐藥性, 因而在水產養殖細菌性疾病的防治中得到廣泛使用[5]。而在水產養殖過程中, 對細菌、寄生蟲等靶病原用藥時, 藥物給養殖動物帶來副作用是不可避免的。隨著DIF應用的越來越廣泛, 導致水產動物不良反應的發生也越來越頻繁[6]。目前在脊椎動物體內的研究表明,喹諾酮類藥物產生的不良反應主要發生在消化系統, 而神經系統是即消化系統后第二大不良反應作用部位[7]。研究發現大部分含有親脂性氟原子的氟喹諾酮類藥物可透過血腦屏障進入腦組織, 通過抑制GABA與GABA A受體的結合, 從而使得中樞神經興奮性增加[7]。大鼠 (Rattus norvegicus) 動脈灌注培氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氟羅沙星和司帕沙星等氟喹諾酮類藥物后, 在其大腦組織中可以檢測到相應藥物的存在[8]。最近, 阮記明等[9]的研究表明DIF可透過異育銀鯽 (Carassais auratus gibebiol) 腦血屏障, 且 DIF在大腦內的消除緩慢, 對中樞神經系統造成的影響具有持久性。DIF等喹諾酮類藥物所造成的不良反應主要包括頭暈、焦慮、恐懼感等, 而魚類、蝦蟹等中樞神經系統的過度興奮將導致魚類急游、耗氧量增加, 死亡率也隨之增加。目前, 有關GABA受體在水產動物領域的研究較少, 其研究仍主要集中在癲癇病治療藥物、抗抑郁等神經藥物和農用殺蟲劑的創新與研制等方面[10—13]。

國內有關藥物分子毒理學的研究工作剛剛起步, 且以藥物受體研究藥物安全性具有針對性、特異性的優勢,因此本研究以GABA A受體作為檢測指標, 從分子水平反映 DIF對水產養殖動物的毒性, 從而評估其藥物安全性, 促進GABA受體在藥物安全性檢測中的應用。GABA A受體由五個亞基組裝而成, 目前已發現的亞基共有 19種 (α1-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、π、θ、ρ1-3 ), 其中, γ2亞基是GABA A受體主要的功能性亞基之一[14], 且84%的GABA A受體包含γ2亞基[15,16]。同時免疫沉淀實驗表明γ2亞基可以同α1、α2、α3、α5、α6、β2、β3、γ3和δ 等亞基共同組裝; 此外, γ2亞基也為氯離子通道正常導電所必需[17]。因此, 我們選取異育銀鯽GABA A受體的γ2亞基作為檢測指標, 為GABA A受體作為藥物安全性評估指標提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物及DIF處理 健康的異育銀鯽購買于江蘇省南通某國營農場, 體重 (61±5.5) g。用2% NaCl浸泡10min, 然后放置于高錳酸鉀消毒后的水族箱 ( 100 cm × 80 cm × 80 cm ) 內暫養2周, 飼喂普通顆粒飼料。試驗期間使用自動控溫系統控制水溫為 (20±2)℃, 24h充氣, 2d換一次水。以4尾未灌藥的異育銀鯽作為空白對照組, 其組織也用于GABA A 受體γ2 亞基mRNA 及蛋白組織特異性表達分析, 所取組織包括腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺。按20 mg/Kg 魚體重標準口灌鹽酸雙氟沙星原料藥溶解液, 分別于給藥后 1h、3h、6h、12h、24h、48h、96h 各取異育銀鯽4尾, 分別取腦、肝、腎、肌、性腺。組織樣品用液氮迅速冷卻, 儲存在–70℃條件下, 用于轉錄水平和蛋白水平的檢測。

主要試劑和儀器 Trizol試劑 (美國Invitrogen 公司), 反轉錄酶、Ex Taq DNA聚合酶 (日本TaKara 公司), iQTMSYBR GREEN Supermix (美國 Bio-Rad 公司), 引物、AXYGEN柱式凝膠回收試劑盒、AXYGEN小量質粒提取試劑盒 (上海生工生物有限公司), BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA強裂解液、6×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、彩色預染蛋白質分子量、考馬斯亮藍染液、顯影液和定影液購自碧云天生物科技有限公司; 兔抗GABAAR γ2多克隆抗體(一抗)(美國 Sigma-Aldrich公司); 兔抗β-actin多克隆抗體(內參一抗)(武漢博士德生物有限公司); ECL超敏化學發光試劑盒(上海威奧生物有限公司); PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)(美國 Bio-Rad 公司), 濾紙(北京索萊寶生物有限公司)。PCR儀為 eppendof Mastercycle Gradient, 核酸測定儀為 eppendof Biophotomter,實時定量PCR儀為BIO-RAD Mini Optica, 165—8001 小型垂直電泳儀 (美國 Bio-Rad 公司); 半干轉膜儀(美國Bio-Rad 公司); 溫控搖床、脫色搖床(美國 Thermo公司)。

1.2 實驗方法

總RNA的提取與反轉錄 分離異育銀鯽腦、肝、腎、心臟、前腸、表皮、肌肉和性腺, 按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計與1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性, –80 ℃保存備用。使用M-MLV反轉錄cDNA。反轉錄體系及反應條件按照試劑盒推薦體系進行。

引物設計、基因片段的克隆及測序 應用 Primer Premier 5.0軟件, 根據 GeneBank發表的斑馬魚 (NM_ 001256250.1) GABA A受體的γ2亞基序列設計一對特異性引物 F1&R1(表 1), 引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應體系及反應條件按照試劑盒推薦體系進行。1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產物, 按瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒操作說明純化回收特異性擴增產物, 并連接至pMD19-T vector 載體, 將鏈接好的質粒轉化感受態DH5, 通過藍白斑篩選和菌落PCR初步鑒定后, 陽性菌落于 37℃震蕩培養過夜。提取質粒后將鑒定為陽性的克隆送上海生工生物科技有限公司進行測序。

表1 本文所用引物Tab. 1 Sequences of primers used in the study

GABA A受體γ2 亞基mRNA表達分析 以獲得的基因序列為模板, 利用 Primer Primer 5.0 軟件設計一對γ2 亞基特異引物F2 & R2 (表 1), 對不同組織(腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺)及雙氟沙星處理后腦、肝、腎、肌肉和性腺中 γ2 亞基 mRNA的表達進行檢測, 并以β-actin 為內參基因, 所用特異性引物F3 & R3見表1。采用iQTMSYBR GREEN Supermix (Bio-Rad) 進行實時定量RCR, 反應體系及反應條件按照試劑盒推薦體系進行。用內參 β-actin對各樣品的 Ct值進行均一化處理, 采用2–ΔΔCt確定不同樣品mRNA的相對含量[18]。

GABA A受體γ2亞基蛋白表達分析 采用Western blot法對不同組織(腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺)及雙氟沙星處理后腦、肝、腎、肌肉和性腺中 γ2 亞基蛋白的表達量進行檢測, 并以β-actin 為內參基因。具體方法為: 按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入裂解液。在勻漿機中研磨, 直至裂解液中組織塊消失。放在4℃靜置30min充分裂解, 并每隔10min強烈振蕩一次。充分裂解后, 4℃、12000 r/min離心20min, 取上清。提取組織總蛋白后, 采用 Brandford法(考馬斯亮藍結合顯色法)蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。將上樣液于100℃的PCR儀中煮沸10min, 使蛋白變性, 并制備11% 分離膠和4% 積層膠, 加電泳緩沖液后上樣電泳。電泳完畢后將蛋白轉印于硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉膜后分別加入兔抗GABAAR γ2多克隆抗體 (1∶200)和兔抗 β-actin (1∶2000)孵育 2h,洗膜, 再加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶2000), 37℃搖床上孵育 2h。洗膜后膜轉入ECL 超敏化學發光試劑(試劑 A∶試劑 B＝1∶1)顯色液中反應2min, 取出膜, 甩去多余的液體, 用保鮮膜包好PVDF膜, 暗室中用X膠片感光、顯影、定影。將Western blot的膠片置于凝膠成像儀中用化學發光法進行檢測、照相, 顯影結果用Quantity One V4.6.2軟件(美國Bio-rad公司)對蛋白質條帶灰度進行半定量分析處理, 結果用GABAAR γ2蛋白目的條帶與 β-actin條帶的灰度值比值表示GABAAR蛋白相對表達強度(GABAAR γ2/β-actin)。

1.3 統計方法

用Excel統計數據, SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析, 以 P＜0.01 (差異極顯著), 0.01＜P＜0.05 (差異顯著), P＞0.05 (差異不顯著) 作為差異顯著性判斷標準, 差異顯著時采用LSD法對各組平均樣之間進行多重比較。結果用平均值±標準差 (Mean±SD)表示, 當P＜0.05時, 差異顯著。

2 結果

2.1 GABA A受體γ2亞基mRNA的組織表達分析

熒光定量PCR結果顯示, 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基和內參的實時熒光定量PCR擴增曲線指數增長明顯,溶解曲線均為單一峰, 擴增效率 E值均接近 1.0, 分別為97.3和 98.3, 表明此條件下目的基因與內參基因的擴增效率一致, 適合作為標準曲線。此外, 4個平行加樣孔之間擴增結果偏差不顯著, 說明此條件下擴增體系和反應條件良好。熒光定量檢測γ2 亞基在異育銀鯽各組織中的表達情況, 以β-actin 為內參基因, 結果顯示, GABA A受體γ2 亞基在腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺中均有表達。其中尤以腦組織中含量最高, 性腺和肝臟次之,前腸中表達水平相對較低, 而在腎臟、肌肉、心臟、表皮中的表達量最低。統計學分析顯示GABA A受體γ2 亞基mRNA在各組織間表達量差異顯著 (P＜0.05) (圖 1)。

2.2 GABA A受體γ2亞基蛋白的組織表達分析

Western blot結果顯示(圖2), β-actin蛋白在各組織中的表達無明顯差異; 以β-actin為內參分析GABA A受體γ2亞基蛋白的表達, 可見GABA A受體γ2亞基蛋白在各組織中均有表達, 其中尤以腦中的含量最多, 性腺次之,肝臟、腎臟、前腸、肌肉、心臟表達水平依次降低, 在皮中表達量最低。統計學分析顯示GABA A受體γ2亞基蛋白在各組織間表達量差異顯著 (P＜0.05) (表2 )。

圖1 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基基因在各組織中的表達情況Fig. 1 Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in different Carassais auratus gibebiol tissues

表2 各組織GABA A受體γ2亞基蛋白相對表達(光密度比值)Tab. 2 The relative protein expression of GABA A receptor γ2 subunit (n=4, x ± s)

圖2 異育銀鯽各組織GABA A受體γ2亞基蛋白表達情況Fig. 2 The protein expression of GABA A receptor γ2 subunit in different tissues of Carassais auratus gibebiol

2.3 DIF對GABA A 受體γ2 亞基mRNA和蛋白表達的影響

實時熒光定量PCR結果 (圖3) 和Western blot結果(圖5) 顯示, DIF可明顯抑制異育銀鯽GABA A受體γ2亞基 mRNA 和蛋白質的表達, 與各組織的空白對照組比較差異有統計學意義 (P＜0.05)。相比于轉錄水平的迅速降低, 蛋白表達水平的降低具有一定的滯后性, 這主要是因為基因到蛋白表達需通過一系列復雜的反應才得以實現的緣故。

圖3 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下mRNA表達情況Fig. 3 The Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

圖4 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下腦組織內mRNA表達情況Fig. 4 The Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in brain of Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

3 討論

3.1 GABA A受體γ2亞基的組織表達特征

運用實時定量PCR和Western Blot檢測GABA A受體γ2 亞基mRNA和蛋白在異育銀鯽腦、肝、腎、心臟、肌肉、前腸、表皮和性腺 8個組織中的表達, 結果發現GABA A受體γ2 亞基在各組織中均有表達, 且在腦組織中其基因水平和蛋白水平的表達量顯著高于其他組織(P＜0.05), 這與GABA A受體是中樞神經系統主要的抑制性神經調節遞質γ-氨基丁酸 (GABA) 的主要受體相符合[13,15]。Pirker等[19], H?rtnagl等[20]的研究發現GABA A受體γ2 亞基在老鼠和家鼠體內也主要分布于腦組織, 且主要集中于海馬區、皮層和小腦等區域。此外, GABA A受體γ2 亞基的基因和蛋白在性腺中也具有一個較高表達水平, Praphaporn Stewart等[21]發現GABA A受體在耳鮑幼體發育過程中的含量明顯增加, 因此, 我們推測GABA A受體除了神經調節功能外, 還將參與異育銀鯽生殖及幼體發育過程。

圖5 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下蛋白表達情況Fig. 5 The protein expression of GABA A receptor γ2 subunit in Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

3.2 DIF對異育銀鯽GABA A受體表達量的影響

與各組織空白對照相比, DIF可明顯抑制 GABA A受體 mRNA和蛋白的表達, 對異育銀鯽各組織存在一定的神經毒性 (圖3、圖5)。另外, 在DIF用藥組實驗中, 我們選取了7個時間點, 分析藥物代謝過程中GABA A受體在各組織中的變化情況, 結果表明藥物在體內濃度越高GABA A 受體的含量越低, 隨著 DIF被魚體不斷代謝, GABA A 受體的含量逐漸回升趨于正常值 (圖3、圖5),這說明GABA A受體表達量與DIF在魚體內的含量成負相關, 可利用GABA A受體在組織中的表達量來推測DIF在魚體不同組織中的含量。

腎臟中GABA A受體mRNA含量在第12h出現二次回落, 肝臟在第24h出現二次回落, 說明DIF在腎臟、肝臟中的含量出現再次回升, 可能是因為 DIF在異育銀鯽體內存在肝腸循環所致。這與章海鑫等[5]、阮記明等[22]的研究結果DIF在異育銀鯽體內的藥時曲線均形成“多峰現象”相一致。

圖3中腦組織受DIF影響后GABA A受體表達模式的變化同其他組織基本一致, 然由于 GABA A受體mRNA在腦組織中的初始表達量是肝臟、腎臟等外周組織的 2萬 至 20萬倍, 因此我們以腦組織空白對照組GABA A受體原始表達量為基準, 單獨構建了腦組織用藥后mRNA表達量變化圖 (圖4), 結果表明用DIF處理后, 腦組織中GABA A受體mRNA表達量降低程度相對更大, 因此DIF對腦組織中GABA A受體含量的抑制效果最顯著, 說明 DIF對水產動物所造成的神經毒性作用在腦組織中最顯著, 與前人研究結果相符[3,6,7]。同時, 相關研究顯示, γ2亞基表達量的降低將導致生物體神經性死亡[23,24], 因此 DIF對水產動物所造成的神經毒性是不可忽視的。

本研究還發現, DIF對腦組織中GABA A受體含量的影響具有持久性, 恢復到原有水平需經過一段較長的代謝周期 (圖3、圖4), 阮記明等[9]的研究表明DIF可透過異育銀鯽腦血屏障, 且正是由于血腦屏障的存在, 導致DIF在腦中的消除半衰期最長, 到試驗第 960h, 大腦組織中DIF 含量較肝臟、腎臟和肌肉中最高。

4 展望

異育銀鯽經DIF處理后, 所有檢測組織中GABA A受體 mRNA和蛋白表達量的影響均有明顯降低, 表明DIF對異育銀鯽各組織器官均有一定的神經毒性作用,然尤以腦組織中含量變化最明顯即神經毒性最顯著。同時,進一步的實驗表明, 隨著DIF被魚體不斷代謝, GABA A受體的含量逐漸回升, 并趨于正常值, 即魚體內DIF含量與GABA A 受體含量呈負相關關系。本實驗說明GABA A受體作為雙氟沙星神經毒性的評估指標是可行的, 并為后期GABA A受體在氟-喹諾酮類藥物對水產動物神經毒性的評估提供理論及實驗基礎, 從而在分子水平上體現藥物對水生動物神經系統的影響。

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SAFETY EVALUATION OF DIFLOXACIN ON CARASSAIS AURATUS GIBEBIOL BASED ON GABA A RECEPTOR

ZHAO Yi-Ni1, SUN Qi1,2, HU Kun1, YANG Xian-Le1, RUAN Ji-Ming1and ZHOU Ai-Ling1
(1. State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Delon Biological Technology Engineering Co., LTD, Shanghai 201306, China)

異育銀鯽; GABA A受體γ2亞基; 克隆; 組織分布; 雙氟沙星; 安全性

Carassais auratus gibebiol; GABA A receptor γ2 subunit; Clone; Tissue distribution; Difloxacin; Safety

S948

A

1000-3207(2015)03-0598-06

10.7541/2015.78

2014-05-06;

2014-10-05

國家科學自然基金“魚類GABA受體與漁藥安全性評價的研究”(31172430); 公益性農業行業專項項目“漁藥使用風險評估及其控制技術研究與示范”(201203085); 863項目“魚蝦用疫苗與藥物研究開發”(2011AA10A216)資助

趙依妮(1992—), 女, 安徽合肥人; 在讀碩士研究生; 主要研究方向為魚類藥物受體, 藥物代謝動力學。E-mail: zhaoyini21@126.com

楊先樂, E-mail: xlyang@shou.edu.cn