微囊藻生長及光合系統Ⅱ對重金屬鎘的響應

冉小飛 劉 瑞 白 芳 施軍瓊 吳忠興

(西南大學生命科學學院, 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室 重慶 400715)

微囊藻生長及光合系統Ⅱ對重金屬鎘的響應

冉小飛 劉 瑞 白 芳 施軍瓊 吳忠興

(西南大學生命科學學院, 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室 重慶 400715)

近年來, 隨著工農業及采礦業的迅速發展, 重金屬對水體環境的污染已經成為了全球性的環境問題[1,2]。鎘是生物有機體的非必需元素, 在環境中以自由離子和配合物的形式存在, 且易被浮游生物吸收。被吸收后的鎘一部分隨著浮游生物的死亡而進入沉積物, 另一部分則隨著食物鏈進行傳遞, 最后被人體吸收, 從而對人體產生毒害作用, 因此被認為是最典型的一種重金屬污染物[3]。

研究表明鎘能夠抑制植物的生長, 破壞葉綠素的合成, 損害放氧復合體(OEC)錳穩定蛋白(MSP)的結構[4],或取代放氧復合體中的Ca2+和葉綠素a的Mg2+等[5]。水生微生物特別是藻類對鎘的敏感性較強[6]。鎘能減少藻類葉綠素合成[7], 抑制藻類生長及光合電子傳遞[8—11]。Guanzon等[12]研究表明, 鎘對藻類生長及光合作用產生了顯著地抑制作用。Neelam and Rai[13]研究發現鎘對藻的毒性部位在于 PS Ⅱ ,然而周文兵等[14]研究表明高濃度鎘脅迫對微囊藻的毒性影響不在PSⅡ和PSⅠ等部位。盡管關于藻類對鎘的響應方面前人已做了大量的工作, 但是在以前的一些研究中, 主要集中探討了短時間Cd脅迫對藻的毒性效應及抗氧化酶活性的響應, 但由于Cd濃度及處理時間的不同產生的結論也呈現出較大的差異性。因此探討Cd脅迫對藻類毒理學機制具有重要的意義。

JIP-測定(JIP-test)是以生物膜能量流動為基礎建立的分析方法, 它能較好的反映 PSⅡ反應中心及電子供體側和受體側的生理狀態。在正常生理條件下, 典型的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線一般包括 O-J-I-P等相, 它記錄了從起始熒光(F0)到最大熒光(Fp或Fm)的整個變化過程[15,16]。O-J-I-P曲線不僅能準確的反映了光合電子傳遞鏈中 PQ庫電子受體連續下降的過程[15], 而且其獲得的JIP參數也能反映光合作用大量的信息, 如: RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0等熒光參數。微囊藻是國內外水體中最常見的水華藍藻,其水華過程產生的大量生物量的危害及后續處理值得廣泛關注[17]。然而, 針對Cd對微囊藻PSⅡ熒光動力學及JIP-參數的研究未見報道。本研究是通過快速葉綠素a熒光誘導動力學曲線(OJIP)的變化, 分析了在低、中、高三個水平脅迫至96h后, Cd對微囊藻PSⅡ光合電子傳遞過程中的能量流動, 反應活性中心及電子傳遞影響, 從而揭示微囊藻對重金屬 Cd的光合響應機制, 為進一步研究富營養化復合污染水體中藻類的重金屬生物修復提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 藻種培養

微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-205)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。藻種置光照培養箱中, 以 MA 培養基靜置培養, 培養條件: 光照強度30 μmol/(m2.s), 溫度(25±1) ,℃ 光暗比12∶12。

1.2 Cd2+濃度設置

將培養至指數生長期藻種離心后, 分別接入含有250 mL培養液的500 mL的錐形瓶中, 接種OD為0.1左右。以滅菌過的50和1000 mg/L Cd2+為母液, 配制成0.2、0.5、1、5、10和20 mg/L的6個濃度。每個濃度組設置三個重復, 以不含Cd2+的MA培養基作為空白對照。每天定時搖動3次, 使藻細胞充分與培養液接觸。

1.3 葉綠素a含量的測定

將藻液脅迫培養至96h, 每個處理各取5 mL的藻液進行離心, 6000 r/min, 離心10min, 去除上清液, 接著將藻細胞用 90%的丙酮在黑暗條件下提取 2次, 每次 24h,最后將提取液定容至 10 mL, 最后使用紫外分光光度計UV-2550在750、663、645、630 nm的波長下測定吸光度[18]。

1.4 快速葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的測定

藻體脅迫培養96h后, 每個處理各取2 mL藻液置黑暗中暗適應 20min后, 測定快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)?？焖偃~綠素熒光誘導動力學曲線采用植物效率分析儀測定(英國漢莎科技有限公司), 測定光強為3000 μmol/(m2.s), 最大激發波長650 nm, 記錄了從10 μs到2s葉綠素熒光的變化過程, 從而準確記錄O-J-I-P等相[19]。藻細胞經充分暗適應后受光激發(20—50) μs時處于初始相O相, 此時PSⅡ反應活性中心處于完全開放狀態, 所測得熒光為初始熒光F0[20]。O-J相的上升過程反映了光合作用的光化學階段, J相對應于F2ms處的熒光, I相時的熒光為F30ms[21]。PSⅡ反應活性中心(RC)處于完全關閉狀態, 不再接受光量子, 熒光產量達到Fp或Fm, P相出現[22], 大約在500 ms—1 s的時間范圍內[23]。K相位于O相與J相之間, 此時的的熒光為F300μs[20]?？焖偃~綠素熒光動力學曲線由O點到P點的所有熒光需進行標準化,以對數形式進行表示。通過 OJIP曲線的變化, 獲得了以下參數: RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0、ABS/RC、DI0/RC、TR0/RC、ET0/RC、M0、Sm?？焖偃~綠素熒光動力學曲線(OJIP)的分析術語及公式如表1所示[24]。

表1 快速葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的分析及公式[24]Tab. 1 Formulae and terms used in the analysis of the O-J-I-P fluorescence induction dynamics curve[24]

1.5 數據統計分析

生物統計分析方法使用SPSS 16.0 (IBM, USA)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)及 LSD多重比較, P＜0.05時認為具有顯著差異, 用*表示, P＜0.01時則認為有極顯著差異, 用**表示。

2 結果

2.1 Cd2+對微囊藻葉綠素a含量的影響

在96h鎘脅迫下, 微囊藻葉綠素a的含量隨著Cd2+濃度的增加而逐漸降低(圖 1)。與對照相比, Cd2+濃度為0.2 mg/L時葉綠素 a的含量沒有顯著的變化, 然而, 當Cd2+濃度大于0.5 mg/L時, 葉綠素a的含量受到了顯著抑制(P＜0.01)。在20 mg/L Cd2+濃度下, 微囊藻葉綠素a含量為對照的12.67%。

圖1 Cd2+對微囊藻葉綠素a含量的影響Fig. 1 Effects of cadmium on Chl. a in Microcysits aeruginosa

2.2 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(O-J-I-P)

在不同 Cd2+濃度脅迫下, 微囊藻快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)的變化情況如圖 2所示。在低濃度Cd2+(0.2—1 mg/L)培養下, 微囊藻的相對可變熒光沒有顯著變化, Cd2+濃度為5和10 mg/L時, 相對可變熒光顯著高于對照, 且I相和P相消失。Cd2+濃度為20 mg/L時, K相出現, 但是J、I、P等相消失。

2.3 葉綠素熒光參數的變化

在不同 Cd2+濃度脅迫下, 微囊藻熒光參數單位受光面積的反應活性中心數量(RC/CS0)、最大光化學效率(ΦP0)、光照2 ms時有活性的反應中心開放程度(ψ0)、反應中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產額(ΦE0)的變化分別如圖3所示。由圖3 A可知, 微囊藻PSⅡ的RC/CS0隨著Cd2+濃度增加而逐漸減少。與對照相比, Cd2+濃度為0.2 mg/L時, Cd2+對 RC/CS0沒有顯著影響, 當濃度高于5 mg/L時, 微囊藻RC/CS0顯著降低(P＜0.01), 分別為對照的16.53%、8%、4.84%。低濃度鎘為0.2 mg/L時, ΦP0顯著高于對照(P＜0.05), 但鎘濃度高于5 mg/L時, Cd2+脅迫顯著抑制了 PSⅡ的最大光化學效率(ΦP0), 鎘濃度為20 mg/L時, ΦP0為空白對照的6.76% (圖3B)。ψ0隨著Cd2+濃度的增加表現了而先減小后增加的趨勢。當 Cd2+濃度小于 1 mg/L時, ψ0沒有顯著變化, 但 Cd2+濃度為 5、10 mg/L時, ψ0顯著低于空白對照(P＜0.01), 但Cd2+濃度為20 mg/L, ψ0顯著高于對照, 為對照的159.25% (圖3C)。微囊藻ΦE0的變化規律與ψ0相似, ΦE0隨著Cd2+濃度的增加呈現了先減小后增加的趨勢。當Cd2+濃度為5、10 mg/L時, 微囊藻ΦE0分別為空白對照的3.17%、1.27%, 當Cd2+濃度為20 mg/L時, ΦE0為對照的10.71%(圖3D)。

微囊藻葉綠素熒光參數反應活性中心所捕獲的光能(ABS/RC)、反應活性中心耗散掉的能量(DI0/RC)、反應活性中心(RC)所捕獲的激發能用于還原QA的能量(使QA減少從而還原成QA–, TR0/RC)、反應活性中心的捕獲的光能用于電子傳遞的能量(QA–-QB–-PQ, ET0/RC)的變化情況(圖4)。與對照相比, 當鎘濃度小于1 mg/L, 微囊藻ABS/RC、DI0/RC沒有明顯的變化, 在Cd2+濃度高于5 mg/L條件下,微囊藻ABS/RC和DI0/RC顯著高于對照(P＜0.01)。與對照相比, 在(0.2—10) mg/L的 Cd2+濃度下, Cd2+對微囊藻TR0/RC沒有顯著影響(P＜0.05), 當Cd2+濃度為20 mg/L時, TR0/RC顯著高于對照(P＜0.01), 為對照的155.54%。ET0/RC呈現不同的特征, 在5、10 mg/L Cd2+濃度下, 微囊藻ET0/RC下降, 分別為對照的13.47%、12.82%, 而濃度為20 mg/L時, ET0/RC顯著高于對照(P＜0.01)。

在不同Cd2+濃度脅迫下, 微囊藻QA的最大還原速率(M0), QA完全被還原所需要的能量(Sm)的變化如圖 5所示。由圖5 A可知, 與對照相比, 微囊藻M0隨著Cd2+濃度的增大而逐漸增加。在Cd2+濃度為5, 10 mg/L 條件下,微囊藻的M0分別為對照的168.93%、179.85%(P＜0.01), 而在20 mg/L時, M0則顯著降低(P＜0.01)。Sm趨勢則與M0相反, 在5、10 mg/L Cd2+濃度下, Sm分別為對照組的0.3%、0.25% (P＜0.01), 而20 mg/L時, Sm則顯著增加(P＜0.01)。

圖2 Cd2+對微囊藻快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)的影響Fig. 2 Effect of cadmium on chlorophyll a fluorescence transients (OJIP) in Microcysits aeruginosa

圖3 不同Cd2+濃度對微囊藻RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0的影響Fig. 3 Effects of cadmium on RC/CS0,ΦP0,ψ0and ΦE0in Microcysits aeruginosa

圖4 Cd2+對微囊藻PSⅡABS/RC、DI0/RC、TR0/RC、ET0/RC的影響Fig. 4 Effects of cadmium on ABS/RC, DI0/RC, TR0/RC and ET0/RC in Microcysits aeruginosa

3 討論

周文兵等[14]研究結果表明高濃度 Cd2+脅迫對微囊藻光合作用的抑制位點不在PSⅡ或PSⅠ等部位, 只是抑制了光合色素CPC和APC的合成。然而, 本研究卻發現高濃度 Cd2+脅迫降低了微囊藻 PSⅡ的光化學活性, 表明Cd2+不僅對微囊藻 PSⅡ供體側的電子供體和受體側電子受體產生了毒害作用, 而且還降低了捕光色素的含量。相比周文兵等[14]的研究, 本研究中鎘對微囊藻的處理時間為 96h, 為其最長處理時間的兩倍。因此, 可以推測短時間的 Cd2+處理對光合色素的合成產生了破壞, 但對 PSⅡ及 PSⅠ中的電子傳遞過程沒有影響, 但隨著處理時間的延長, Cd2+對放氧復合體(OEC)及PSⅡ電子傳遞產生了破壞作用, 導致微囊藻光合作用受到抑制。此外, 本研究也發現不同濃度Cd2+脅迫對微囊藻生長及PSⅡ光化學活性的影響不同。在低濃度Cd2+(0.2 mg/L)脅迫下, Cd2+對微囊藻生長及 PSⅡ光化學活性沒有顯著影響, 支持了 Luka?和Aegerter[15]的結論, 即在低濃度鎘(0.001—0.20 μmol/L)脅迫下, 鎘對藻的生長沒有顯著的影響。在中濃度 Cd2+脅迫下(0.5—1 mg/L), Cd2+對微囊藻PSⅡ葉綠素a的合成及反應中心產生了抑制作用, 但對微囊藻的 PSⅡ的光能吸收及電子傳遞沒有顯著地影響。然而, 在高濃度 Cd2+脅迫下(5—10 mg/L), Cd2+對微囊藻的PSⅡ的光能吸收及電子傳遞產生了顯著地毒害作用, J相迅速升高, I相和P相消失。這些結果表明在中、高濃度條件下, Cd2+使PSⅡ的反應活性中心(RC)上的 D1蛋白降解加劇[16], 導致電子傳遞體特別是QB易從蛋白復合體上脫落下來, 使得PSⅡ反應活性中心的數量大量減少并使大部分反應活性中心關閉, 導致了反應活性中心(RC)捕獲的能量更多地用于QA還原為 QA–, 減少了用于電子傳遞的能量, 進而抑制了QA–到QB的電子傳遞, QA–大量積累, PQ庫的庫容量減小[20],表現為J點升高[25]。I相時電子受體主要狀態為QA–QB–[26], P相時QA完全被還原, PSⅡ的反應活性中心完全關閉[26]。I相和P相消失是由于高濃度Cd2+條件下, Cd2+對PSⅡ電子傳遞的產生了極大的破壞。當Cd2+濃度為20 mg/L時, Cd2+對微囊藻 PSⅡ供體側的電子供體和受體側都的電子受體產生了毒害作用, 在此濃度下放氧復合體(OEC)受到了極大地破壞, K相出現, 表明此濃度導致了錳簇復合可能從放氧復合體上的裂解下來[27]。

綜上所述, 高濃度Cd2+脅迫破壞了PSⅡ的反應活性中心, 使反應活性中心的數量降低及使部分反應活性中心關閉, 并且抑制了PS Ⅱ QA–到PQ庫的電子傳遞, 受體側的電子受體庫容量(Sm)減小, 進而導致 J點的升高。高Cd2+濃度(20 mg/L)破壞了放氧復合體(OEC)的結構。因此,鎘對微囊藻的毒性效應主要表現為抑制 PSⅡ的反應中心和電子傳遞, 對 PSⅡ供體側的電子供體和受體側的電子受體都產生了毒害, 進而抑制了光合作用。

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THE RESPONSE ON THE GROWTH AND PHOTOSYSTEM II OF MICROCYSTIS AERUGINOSA TO CADMIUM, A HEAVY METAL

RAN Xiao-Fei, LIU Rui, BAI Fang, SHI Jun-Qiong and WU Zhong-Xing
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

鎘; 微囊藻; 葉綠素熒光動力學曲線(OJIP); 光合系統Ⅱ(PSⅡ); 熒光參數

Cadmium; Microcystis aeruginosa; Chlorophyll fluorescence induction curve (OJIP); Photosystem Ⅱ(PS ); Fluorescence parameterⅡ

Q948.11

A

1000-3207(2015)03-0627-06

10.7541/2015.83

2014-05-29;

2014-08-12

西南大學博士基金(SWU110065); 國家自然科學基金(31170372)資助

冉小飛(1990—), 女, 貴州沿河人; 碩士研究生; 主要從事藻類生態學研究。E-mail: 18883251847@163.com

吳忠興(1975—), 男, 教授; 主要從事藻類生理生態及分子系統性學研究。E-mail: wuzhx@swu.edu.cn