福建地區豬繁殖與呼吸綜合征ORF7基因遺傳變異分析

劉建奎，魏春華，戴愛玲，李曉華，楊小燕（龍巖學院生命科學學院預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術研究中心，福建龍巖364012）

福建地區豬繁殖與呼吸綜合征ORF7基因遺傳變異分析

劉建奎，魏春華，戴愛玲，李曉華，楊小燕
（龍巖學院生命科學學院預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，
福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術研究中心，福建龍巖364012）

摘要：為了解福建地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物學特性與變異規律，收集了福建省不同地區的12株PRRSV，并對其ORF7基因進行遺傳變異分析。結果表明，福建地區存在歐洲型PRRS和美洲型PRRS，10株為美洲型PRRSV，與VR-2332、JXA1等美洲型參考毒株的氨基酸的同源性為89.5%～100%，與歐洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分別為59.5%～63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分離株為歐洲型PRRSV，與歐洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分別為91.4%、92.2%，而與VR-2332、CH-1а等美洲參考毒株的氨基酸的同源性為60.3%～64.5%。美洲型PRRSV ORF7編碼N蛋白氨基酸雖然發生了變異，但相對保守。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF7基因；遺傳變異

Corresponding author：YANG Xiao-yan

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，給各國養豬業造成巨大的經濟損失。PRRS首先于1987在美國發生，1991年首次分離于歐洲，我國于1996年首次發現并分離到PRRSV。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，約15 kb，有9個開放閱讀框[1-2]。PRRSV可以分為2種基因型，即以LV毒株為代表的歐洲型和VR-2332毒株為代表的美洲型，兩者之間的核苷酸同源性為60%左右[3]。ORF7編碼的N蛋白保守性較好，在病毒粒子中含量較高，在病毒組裝和釋放中發揮重要作用，并且具有良好的免疫原性和反應原性[4-5]。

研究表明，根據ORF7基因序列與基于全基因組序列構建的遺傳進化樹最為吻合，因此ORF7基因可作為研究PRRSV遺傳進化的重要靶基因[6-8]。本文通過對福建地區PRRSV ORF7基因進行序列分析，探求其分子流行特征和變異規律，以期為控制PRRS的流行提供一定的參考依據。

1　材料與方法

1.1病毒樣品2009-2013年在福建省的龍巖、廈門、漳州等地區采集疑似PRRS病料，由本實驗室分離鑒定并保存的12株PRRSV。

1.2主要試劑M-MuLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶，均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3引物參考VR-2332和LV序列，設計一對能同時擴增歐美毒株ORF7基因的引物，擴增片段大小約為630 bp，引物由華大基因科技服務有限公司合成。

1.4RT-PCR擴增用TRIZol裂解法提取病毒RNA，按照TaKaRa試劑盒說明書進行RT-PCR。

1.5目的基因的克隆與序列分析將陽性重組菌株交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。利用MEGA 6.0軟件對ORF7基因序列進行遺傳變異分析。

2　結果

2.1RT-PCR擴增結果12株PRRSV分離株ORF7基因經RT-PCR擴增后，結果顯示在約630 bp出現與預期大小相符的片段（圖1）。

2.2ORF7基因序列分析及基因推導氨基酸序列的變異分析測序結果表明，FJ01-FJ10等10株分離株的ORF7基因序列與VR-2332、CH-1а、JXA1等美洲PRRSV毒株的核苷酸、推導氨基酸的同源性分別為89.8%～99.7%和89.5%～100%，而與歐洲代表毒株LV的核苷酸、推導氨基酸的同源性分別為67.5%～68.3%和59.5%～63.6%。N蛋白氨基酸位點變異分析表明，與VR-2332株相比福建地區毒株大部分發生散在的點突變，其中R11→K11、D15→N15、K46→R46、T91→A91，H109→Q109、V117→A117的突變相同，在N蛋白較為保守的B細胞表位（79 -87 aa）中，只有FJ-05、FJ-08和FJ-09株發生了Q80→H/R80的突變，其余毒株均未發生突變。FJ-11、FJ-12 2株分離株的ORF7基因序列與歐洲代表毒株LV的核苷酸、推導氨基酸的同源性分別為92.4%、93.5%和91.4%、92.2%，而與VR-2332、CH-1а、JXA1等美洲毒株的核苷酸、推導氨基酸的同源性分別為66.1%～66.9%和60.3%～64.5%（圖2，圖3），N蛋白氨基酸位點變異分析表明，與LV株相比FJ-11、FJ-12 2株分離株有散在的點突變，其中I34→M34、K58→R58、A127→V127的突變相同，其中FJ-11株在128位缺失一個氨基酸。

圖1　PRRSV福建分離株ORF7基因的RT- PCR擴增結果

2.3ORF7基因的遺傳進化樹分析將福建省PRRSV分離株與國內外PRRSV參考毒株的ORF7氨基酸序遺傳進化樹分析，結果見圖4，從進化樹可看出福建12株分離株為兩大基因群，即以VR-2332為代表的美洲毒株群和以LV為代表的歐洲毒株群。美洲毒株群分為兩個亞群，以FJ-01為代表的6株分離株與其他HP-PRRSV變異株(如JXA1、HuN4等)位于同一大分支中，親緣關系較近。以FJ-07為代表的3株分離株與VR2332親緣關系較近同一大分支中。FJ-11和FJ-12 2株分離株與LV毒株位于一個大的分支中，親緣關系較近，表明這兩株毒株為歐洲型PRRSV。

圖2　PRRSV福建分離株與參考株ORF7基因推導氨荃酸序列的比較

圖3　PRRSV福建分離株與參考株ORF7基因推導氨基酸序列的比較

圖4　PRRSV福建分離株與參考毒株ORF7氨基酸序列系統進化樹分析

3　討論

ORF7基因編碼的N蛋白是病毒粒子中含量最高的蛋白，也是免疫原性最強的蛋白。N蛋白不僅是目前PRRS血清學診斷方法的抗原基礎，還是PRRSV基因分型和抗原分型的主要依據[6-8]。因此本研究對12株PRRSV ORF7基因序列及其所編碼的蛋白進行變異分析，為科學預防該病提供參考依據。

以FJ-01為代表的10株美洲型福建PRRSV分離毒株ORF7基因推導的氨基酸序列同源性為89.5%～100%，與美洲型代表株VR-2332、JXA1等毒株推導氨基酸的同源性分別為89.5%～100%，而與歐洲代表毒株LV推導氨基酸的同源性為59.5%～63.6%。FJ-11、FJ-12 2株分離株的ORF7基因推導的氨基酸序列歐洲代表毒株LV的ORF7基因推導氨基酸的同源性分別為92.4%和93.5%，而與VR-2332、JXA1等美洲毒株ORF7基因推導氨基酸的同源性為60.3%～64.5%。氨基酸遺傳進化樹表明，福建地區PRRSV分離株分為2個基因群，以FJ-01為代表的美洲基因群和以FJ-11、FJ-12為代表的歐洲基因群，美洲基因群分為兩大亞群，以Ⅰ亞群為主，以FJ-01為代表的6株毒株其他HP-PRRSV變異株（如JXA1、HuN4等）親緣關系較近，位于同一分支，表明這6株分離株可能為變異毒株。Ⅱ亞群中FJ-08和FJ-09毒株與疫苗株親緣關系較近為獨立的一個小分支且存在多個有散在的點突變，可能在選擇壓力（免疫和環境壓力等）下由疫苗株變異而來，而II亞群中FJ-07和疫苗株序列一致，表明該毒株為疫苗株。氨基酸位點分析發現與VR-2332株相比，福建地區美洲型毒株大部分發生散在的點突變，而33-71aa，74-86 aa，102-125 aa為N蛋白的保守區域。在N蛋白較為保守的B細胞表位（79-87 aa）中，只有FJ-05、FJ-08和FJ-09發生了Q80→H/R80的突變，其余毒株均未發生突變，表明B細胞表位所在的區域高度保守。與LV株相比F-J11、FJ-12 2株分離株有散在的點突變，其中FJ-11分離株在128位缺失一個氨基酸。這些位點的突變及缺失對N蛋白的抗原性及對PRRSV的致病性有何影響，還有待于進一步研究。同時，福建地區田間存在歐洲型PRRS，但是關于歐洲型PRRS的來源和生物學特性需要進一步研究。

綜上所述，福建地區美洲型PRRSV ORF7基因高度保守，N蛋白仍是現今較為理想的檢測抗原，應該考慮到由于PRRSV不斷變異，不同毒株的ORF7基因序列有一定的差異性。同時應該加大對歐洲型PRRSV的監控力度，采取有效的防控措施避免歐洲型PRRSV的流行。

參考文獻：

[1] Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，et al.Current knowledge on the

structural proteins of porcine reproductive and respiratory syn?drome（PRRS）virus: comparison of the North American and Euro?pean isolates [J].Arch Virol，2000，145（4）：659-688.

[2] Meulenberg J J，Hulst M M，de Meijer E J，et al.Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS），is related to LDV and EAV [J] . Virology，1993，192（1）：62-72.

[3] Nelsen C J，Murtaugh M P，Faaberg K S . Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison：divergent evolution on two continents [J].J Virol，1999，73：270-280．

[4] Conzelmann K K，Visser N，Van Woensel P，et al . Molecu?lar characterization of porcine reproductive and respiratory syn?drome virus，a member of the arterivirus group[J] . Virol，1993，193：329-339.

[5] Bastos R G，Dellagostin O A，Barletta R G，et al . Immune re?sponse of pigs inoculated with Mycobacterium bovis BCG express?ing a truncatedform of GP5 and M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].Vaccine，2004，22：467-474.

[6] Kang S Y，Yun S I，Park H S，et al.Molecular characterization of PL97-1，the first Korean isolate ofthe porcine reproductive an?drespiratory syndrome virus.Virus Res，2004：104（2）：165-179.

[7] Yoon S H，Song J Y，Lee C H，et al . Genetic characterization of the Korean porcine reproductive and respiratory syndrome viruses?based on the nucleocapsid protein gene（ORF7）sequences[J].Arch Virol，2008，153（4）：627-635.

[8] Hao X，Lu Z，Kuang W，et al.Polymorphic genetic characteriza?tion of the ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syn?drome virus（PRRSV）in China.Virol J，2011，8：73.

Genetic variation of the ORF7 geneof porcinereproductiveand respiratory syndromevirus isolated in Fujian province

LIU Jian-kui，WEI Chun-hua，DAI Ai-ling，LI Xiao-hua，YANG Xiao-yan
（College of Life Sciences of Longyan University，Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，Engineering Research Center for the Prevention and Control of Zoonosis，Longyan 364000，China）

Abstract：To study the genetic diversity the molecular epidemiology and phylogenetic relationship of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in Fujian province the ORF7 gene from 12 PRRSV isolates isolated from 2009 to 2013 were sequenced and analyzed.The results showed that European type PRRS and American type PRRS existed in Fujian.Ten isolates be?longed to PRRSV American type shared 89.5%～100%amino acids identity with other American type PRRSV reference strains，but shared only 59.5%～63.6% identity with LV strain.Two isolates belonged to PRRSV European type shared 91.4% and 92.2% amino acids identity with LV respectively，but shared only 60.3%～64.5% identity with other American type PRRSV reference strains.Although there is variation in the N protein of the American strain, it is relatively conserved among strains in Fujian.

Key words：PRRSV；ORF7 gene；Genetic variation

通訊作者：楊小燕，E-mail：lyyxy1988@126.com

作者簡介：劉建奎（1982-），男，實驗師，碩士，主要從事分子病原學研究，E-mail：liujiankui99@126.com

基金項目：福建省自然科學基金（2011J01233）；龍巖學院百名青年教師攀登項目（LQ2013022）

收稿日期：2014-07-15

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0017- 03