急性熱應激對小鼠肺組織中熱應激蛋白和細胞因子基因表達的影響

于　靜，薛　佳，胡艷欣，汪　明（中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193）

急性熱應激對小鼠肺組織中熱應激蛋白和細胞因子基因表達的影響

于靜，薛佳，胡艷欣，汪明
（中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193）

摘要：為研究小鼠在急性熱應激條件下肺組織中幾種熱應激蛋白（heat shock proteins，HSPs）及一些細胞因子基因表達水平的變化情況，通過實時熒光定量PCR的方法檢測小鼠急性熱應激前后肺組織中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110及白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、β干擾素（IFN-β）及γ干擾素（IFN-γ）的mRNA水平變化情況。結果顯示，所有檢測的熱應激蛋白和細胞因子在熱應激后0 h至2 h過程中均極顯著升高（P<0.01），到4 h時恢復到正常水平。此試驗結果為揭示急性熱應激提高機體的抗病能力提供有價值的資料。

關鍵詞：熱應激；熱應激蛋白；細胞因子；熒光定量PCR

中圖分類號：S816.4

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0020- 04

Corresponding author：WANG Ming

熱應激，是指當環境溫度超過動物和人體舒適溫度（產熱最低點與蒸發散熱急劇增加起始點之間溫度）時，動物和人為保護其正常的代謝作用，其各種生理機制所必須做出的各種反應的總和。有研究表明，短暫急性應激（27.5℃，1 h）能夠增強西伯利亞鱘的非特異性免疫[1]；急性熱應激（34℃，24 h）能夠提升肉鵪鶉的抗氧化性能[2]；運動之前的急性熱應激（41℃，20 min）能夠保護機體免受肌肉損傷[3]；印度的醫學文獻中記載，熱敷即熱應激用于機體從寒冷、腸絞痛、僵硬、遲緩中恢復正常功能的治療。本課題組前期試驗證明，急性熱應激（4 h，39℃±1℃）可以顯著提高小鼠抵抗流感病毒的能力。因此，急性熱應激提高機體抗病能力的機制成為需要進一步闡明的問題。

熱應激蛋白（heat shock proteins，HSPs）分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP和泛素等6個家族[4]。HSPs是一組在生物體中高度保守并具有重要生理功能的蛋白質分子家族[5]。大量的研究已經充分證明，HSPs具有分子伴侶作用及廣泛的免疫學生物活性[6-7]?？茖W家們已經開始普遍關注HSP與機體腫瘤發生和控制、自身免疫耐受形成及自身免疫疾病發生等重大免疫學問題的關系。此外，人們也積極地將HSP用于抗細菌、病毒、寄生蟲和腫瘤新型疫苗的研制當中，并取得了一系列可喜的成果。

細胞因子（cytokine，CK）即主要由免疫細胞分泌的、能調節細胞功能的小分子肽。主要參與調節免疫應答及炎癥反應，刺激造血功能，參與組織修復等。當細胞因子與相應受體結合后，能通過靶細胞膜上的相應受體將信息傳遞到細胞核內，激活或抑制某些轉錄因子，從而誘導新蛋白的合成。這些新合成的蛋白發揮其生物學功能，形成免疫網絡以保證機體的正常免疫應答及維持機體的平衡。

本試驗通過研究急性熱應激后小鼠肺組織內各種熱應激蛋白和一些細胞因子基因表達的變化，為揭示急性熱應激提高機體抗病毒能力的機制提供有價值的資料。

1　材料與方法

1.1實驗動物小鼠：體重20 g左右6～8周齡雌性BALB/C小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2小鼠的急性熱應激與采樣將小鼠放于鼠籠中，鼠籠置于39℃±1℃溫箱中熱應激4 h，取出，在0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h 5個時間點頸椎脫臼處死，取米粒大小肺組織放入凍存管中，置于液氮中保存待用。

1.3熒光定量PCR法測定基因表達情況

1.3.1引物的設計根據GenBank上發表的序列，應用Primer Premier5.0設計熒光定量PCR引物（見表1），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　熒光定量PCR法所用引物

1.3.2反應條件95℃10 min；95℃15 s，50℃30 s，72℃45 s（讀板）共40個循環。

1.4數據的分析處理本試驗采用2-ΔΔCt法對細胞因子基因進行相對定量分析，選β-actin為內參基因[8-9]。用SPSS 10.0統計軟件進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 5.0醫學繪圖軟件對測得的數據進行統計作圖。

2　結果與分析

2.1急性熱應激對小鼠肺組織HSPs基因表達的影響如圖1所示，39℃±1℃熱應激4 h后，小鼠肺組織中各種熱應激蛋白（HSP27，HSP60， HSP70，HSP90，HSP110）的表達量在零點時即呈現高表達，持續到2 h其表達量均極顯著高于對照組小鼠（P<0.01），到4 h時降低到正常水平。

2.2急性熱應激對小鼠肺組織細胞因子表達的影響如圖2所示，39℃±1℃熱應激4 h后，小鼠肺組織中IL-6, IL-17, TNF-α，IFN-β及IFN-γ的表達量均有所上升。其中，IL-6，IFN-β及IFN-γ的表達量在零點時即呈現高表達，在0.5 h表達量有所下降，而1 h后表達量大幅上升，持續到2 h其表達量均極顯著高于對照組小鼠（P<0.01），到4 h降低到正常水平；IL-17和TNF-α的表達情況雖然較對照組而言上升顯著（P<0.05），但較其他細胞因子而言不夠穩定，上升幅度較小。

3　討論

HSPs在炎癥中有保護作用，當病原體侵入宿主后，可引起巨噬細胞吞噬，高濃度活性氧族（ROS）產生，淋巴細胞釋放細胞因子IL-1、IL-2、IL-8及TNF等，ROS及細胞因子上調HSPs，激活HSPs基因，增強HSPs的表達；反過來，HSPs通過抑制ROS及細胞因子起到保護細胞和組織免疫炎癥損傷的作用[10]。本試驗結果顯示，在急性熱應激后，小鼠肺組織中多種HSPs的基因表達均有顯著上升，能夠加強機體對炎癥的保護作用。

IL-6能誘導B細胞分化并產生免疫球蛋白、激活NK細胞、加速肝細胞急性期蛋白的合成、能被IL-1β和TNF-α誘導表達，同時又能在炎癥反應中起調節作用，抑制IL-1β和TNF-α的過度表達，兼有促炎及抗炎作用[11]。IL-17是一種主要由活化的T細胞產生的致炎細胞因子，可以促進T細胞的激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子從而導致炎癥的產生。TNF-α是經典的促炎因子，能促進局部和全身的炎性反應，有類似IFN的抗病毒作用，可促進CTL表達MHC-I類抗原并增強CTL對病毒感染細胞的殺傷作用[12-13]。IFN-β具有廣譜抗病毒作用及免疫調節作用，能促進大多數MHC I類抗原的表達，活化NK細胞和CTL，能抑制和殺傷腫瘤細胞[14]。IFN-γ是最重要的Th2型細胞因子，又稱II型干擾素，主要由T細胞和NK細胞產生，可以誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及成纖維細胞等MHC II類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程，能夠促進巨噬細胞FcγR的表達并促進巨噬細胞殺傷病原微生物，并協同IL-2共同誘導淋巴細胞活化殺傷細胞（Lympho?kine active killer cells，LAK）的殺傷活性，促進T細胞表達IL-2R[15]。這些細胞因子的高表達有利于病毒感染時機體對病毒粒子的清除，能夠起到保護機體抵抗病毒感染的作用。

圖1　急性熱應激對小鼠肺組織中熱應激蛋白表達的影響

綜上所述，本試驗通過檢測急性熱應激后小鼠肺組織內多種HSPs和細胞因子的表達情況，揭示了急性熱應激提高機體對病毒抵抗力可能與刺激多種熱應激蛋白及相關抗病毒細胞因子的上調表達有關，為進一步研究急性熱應激保護機體的機制奠定了基礎。

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圖2　急性熱應激對小鼠肺組織中細胞因子表達的影響

Theeffects of acuteheat stress on geneexpression of several HSPs and cytokines in lung tissueof mice

YU Jing，XUE Jia，HU Yan-xin，WANG Ming
（College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China）

Abstract：The purpose of this study is to analyze the changes of several heat shock proteins（HSPs）and cytokines under the condition of acute heat stress in a mouse model.The changes of heat shock proteins（HSP27，HSP60，HSP70，HSP90 and HSP110）and cytokines（IL-6，IL-17，TNF-α，IFN-β and IFN-γ）before and after heat stress in the lung were determined by the method of RT-PCR on mRNA level .The results showed that the expression of the HSPs and cytokines were up-regulated after acute heat stress.These results will provide valuable information for the study of the protective roles of acute heat stress.

Key words：heat stress；Heat Shock Proteins；cytokines；Real Time PCR

通訊作者：汪明，E-mail：vetdean@cau.edu.cn

作者簡介：于靜（1989-），女，碩士生，從事預防獸醫學研究，E-mail：yujing19891029@126.com

收稿日期：2014-07-14