ASAP1蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

張　婷,劉文俊

(武漢市漢口醫院 a.檢驗科 b.病理科,武漢 430012)

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ASAP1蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

張婷a※,劉文俊b

(武漢市漢口醫院 a.檢驗科 b.病理科,武漢 430012)

摘要：目的檢測乳腺癌組織中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)蛋白的表達,探討ASAP1與乳腺癌發生的相關性,為乳腺癌的防治尋找新的靶點。方法采用單純隨機抽樣選取2008年6月至2012年6月武漢市漢口醫院就診乳腺癌患者41例，進行免疫組織化學檢測并分析乳腺癌組織中增殖細胞相關核抗原Ki67、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和人表皮生長因子受體2(HER2)的表達與ASAP1的相關性；比較不同轉移能力乳腺癌細胞株中ASAP1與HER2水平；檢測RNA干擾抑制ASAP1對MDA-MB-231細胞中血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響，對照組MDA-MB-231細胞培養體系中加入陰性對照干擾小RNA。結果免疫組織化學顯示乳腺癌組織中HER-2的表達與ASAP1無相關性(P=0.803),Ki67和MMP-2的表達與ASAP1有顯著相關性(P=0.035;P=0.013)；免疫印跡顯示高侵襲力乳腺癌細胞中ASAP1高表達,低侵襲力乳腺癌細胞ASAPI呈弱表達(P<0.01)，HER-2的表達與ASAP1無相關性(P>0.05)；RNA干擾抑制MDA-MB-231細胞中ASAP1的表達,VEGF水平顯著低于對照組(P<0.01)。結論乳腺癌組織中ASAP1的表達與腫瘤細胞的增殖和轉移存在相關性,ASAP1有望成為乳腺癌的治療靶點 。

關鍵詞:乳腺癌；ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1； 增殖細胞相關核抗原Ki67；基質金屬蛋白酶2；人表皮生長因子受體2

腫瘤的形成是一個多步驟、多階段的復雜過程,在此過程中, 增殖細胞相關核抗原Ki67(proliferating antigen Ki67)、基 質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表達與腫瘤細胞的增殖、轉移和療效預后相關[1-4],ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ArfGAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1,ASAP1)是近年來新發現的一類腫瘤相關蛋白,其在乳腺癌中的臨床價值有待深入研究。本研究通過分析乳腺癌組織中ASAP1與Ki67、MMP-2、HER2表達的相關性,并在乳腺癌細胞系中觀察ASAP1表達與腫瘤細胞轉移的相關性及對血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的影響,為乳腺癌的防治研究提供線索。

1材料與方法

1.1標本來源41例乳腺癌標本取自2008年6月至2012年6月武漢市漢口醫院收治的原發性乳腺癌患者手術切除組織?；颊呔鶠榕?年齡31～67歲,平均(48±8)歲,術前未做化療和放射治療。

1.2細胞株乳腺癌細胞系MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7購自武漢大學細胞典藏中心。

1.3主要試劑和儀器免疫組織化學一抗ASAP1(ab12423,產品批號：Ab100114001)、Ki67(RB-9043,產品批號：091215405F)、MMP-2(MAB-0244,產品批號：100124307A)及HER-2(RAB-0156,產品批號：091120204K)分別購自英國abcam 公司和福州邁新生物技術開發有限公司。二抗購自Pierce公司(產品批號：100507299)。ASAP1 干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)(sc-41695,產品批號：sc-100102695)購自美國Santa Cruz公司,VEGF檢測試劑盒購自晶美公司(產品批號：090920204c)。HH.CP-01型二氧化碳培養箱購自中國上海博訊公司，165-8001型垂直電泳槽購自美國BIO-RAD公司； HC-2518R高速冷凍離心機購自安徽科大創新公司(離心半徑 6 cm)；BSG-4型生物安全柜購自中國珠海再鑫公司。

1.4方法

1.4.1免疫組織化學標本均由10%中性甲醛固定,常規石蠟包埋、切片和染色,一抗稀釋度(1∶500)。首先觀察其病理形態學改變,然后應用免疫組織化學(SP法)檢測Ki67、MMP-2和HER2的表達與ASAP1在41例乳腺癌細胞中的表達情況。另取癌旁非腫瘤的正常組織石蠟標本為對照。陽性結果判斷：著色部位棕黃色顆粒為陽性,并以陽性細胞比率為主，記為-(不著色)、+(0～25%)、++(25%～50%)、+++(>50%),其中-～+為低表達,++～+++為高表達。

1.4.2Western blot分別離心收集對數生長期的MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7細胞,磷酸鹽緩沖液洗滌,蛋白提取緩沖液充分裂解,4 ℃,15 000 r/min離心10 min,收集上清。蛋白定量后,10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離,轉膜,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。分別加一抗Ki67、MMP-2和HER2的表達與ASAP1；二抗；電化學發光法系統顯影。

1.4.3siRNA檢測用Lipofectmine2000試劑轉染對照siRNA,ASAP1 siRNA至MDA-MB-231細胞,48 h后離心收集細胞,磷酸鹽緩沖液洗滌。部分細胞用Trizol試劑提取RNA進行半定量反轉錄-聚合酶鏈反應和1.5%瓊脂糖凝膠電泳,其余細胞用蛋白提取緩沖液裂解,離心收集上清,進行后續的蛋白質印跡檢測。

1.4.4VEGF檢測收集細胞培養物上清,3000 r/min,離心20 min,采用酶聯免疫吸附測定法檢測,具體操作見試劑盒說明書,檢測重復3次。

2結果

2.1乳腺癌組織中ASAP1表達與Ki67、MMP-2和HER2的相關性免疫組織化學顯示，ASAP1主要表達在細胞質或膜表面中,正常組織為陰性或低表達,乳腺癌組織可呈陽性或強陽性(圖1),41例乳腺癌患者癌基因HER2表達與ASAP1表達水平無相關性(P=0.803)；而Ki67表達與ASAP1表達水平顯著相關,其中20例Ki67高表達標本中有15例ASAP1高表達,21例Ki67低表達標本中有8例ASAP1高表達(P=0.035)； MMP-2高表達與ASAP1表達水平顯著相關(P=0.013),其中21例MMP-2高表達標本中有17例ASAP1高表達,20例MMP-2低表達標本中有8例ASAP1高表達。 見表1。

圖1乳腺癌組織中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)的表達(二氨基聯苯胺染色×200)1A：ASAP1(+++)；1B：ASAP1(++)；1C：ASAP1(+)；1D：ASAP1(-)

2.2ASAP1表達對乳腺癌細胞侵襲性的影響免疫印跡檢測顯示ASAP1表達水平高侵襲力乳腺癌細胞MDA-MB-231中為(0.76±0.09)，低侵襲力乳腺癌細胞SKRB3表達水平為(0.37±0.07),MCF-7表達水平為(0.31±0.05),高侵襲力乳腺癌細胞MDA-MB-231表達水平顯著高于低侵襲力乳腺癌細胞SKRB3和MCF-7(F=35.180，P<0.01)；而HER2在三種細胞的表達依次為(0.33±0.05)、(0.67±0.11)和(0.23±0.07)，ASAP1的表達與HER2無顯著相關性(r=0.20，P=0.599)(圖2)。

2.3siRNA抑制ASAP1對MDA-MB-231細胞ASAP1蛋白表達的影響干擾組ASAP1的基因相對表達水平為(0.37±0.13)，對照組ASAP1的基因相對表達水平(0.72±0.21)，干擾組ASAP1的基因相對表達水平顯著低于對照組(t=-6.060,P=0.020); 干擾組ASAP1蛋白相對表達水平(0.33±0.07)，對照組ASAP1蛋白相對表達水平為(0.63±0.11)，干擾組ASAP1蛋白相對表達水平顯著低于對照組(t=12.990,P=0.010)(圖3)。

2.4RNA干擾抑制ASAP1對MDA-MB-231細胞 VEGF表達的影響ASAP1被抑制后,MDA-MB-231細胞培養上清液中干擾組VEGF為(59±21 ) μg/L，顯著低于對照組[(182±35) μg/L](t=56.90,P<0.05)。

3討論

轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征,在此過程中,腫瘤細胞需要穿越組織屏障,才能向周圍侵襲和轉移。研究發現MMP-2具有降解細胞外基質和基膜的功能,MMP-2高表達與腫瘤的轉移和侵襲相關[1-2],而腫瘤的轉移往往伴隨著細胞的活躍增殖,目前公認的反映腫瘤細胞增殖力的指標是Ki67抗原,Ki67是一種存在于增殖細胞中的細胞核抗原,其表達水平與腫瘤增殖的活躍程度及預后呈正相關[3]。我國每年新診斷為乳腺癌的患者已增至近17萬人,盡管Herceptin針對HER2過度表達乳腺癌的靶向治療已取得明顯療效,但由于高額的治療費用和耐藥性的發生[5],每年死亡人數仍近4萬人,因此乳腺癌的療效和預后的研究顯得尤為重要。近年來先后在卵巢癌、前列腺癌及胃癌等腫瘤中發現一類新的反映腫瘤轉移和侵襲的蛋白ASAP1,它是Arf-GTP酶的受體,參與細胞膜轉運和骨架蛋白的重構[6-8],ASAP1與乳腺癌相關性的研究國內目前少有報道,本研究在臨床乳腺癌病理組織中對HER2、Ki67及MMP-2與ASAP1表達相關性進行了分析,結果顯示ASAP1不僅與乳腺癌細胞轉移相關,而且還是細胞增殖的指標,值得關注的是在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中均發現ASAP1的表達與乳腺癌基因HER2的表達無相關性，這一現象國內外文獻均少見報道,推測HER2與ASAP1的表達缺乏共同的信號調控通路,說明HER2與ASAP1均高表達的乳腺癌在治療上將更加困難,因為同一類藥物可能無法同時抑制HER2與ASAP1的表達；由于已經報道的ASAP1的主要功能是參與腫瘤的轉移,為了進一步驗證其作用,本研究采用RNA干擾抑制高轉移性乳腺癌細胞MDA-MB-231中ASAP1的表達時,檢測發現與腫瘤生長和轉移密切相關的VEGF水平顯著降低,進一步證明了ASAP1在腫瘤轉移中的作用。

表1　乳腺癌組織中HER2和Ki67及MMP-2 與

HER2：人表皮生長因子受體2；Ki67：增殖細胞相關核抗原；MMP-2：基質金屬蛋白酶2； ASAP1：ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1

圖2不同轉移性乳腺癌細胞中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)和人表皮生長因子受體2(HER2)的表達

圖3ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)基因(左)和蛋白(右)水平檢測RNA干擾ASAP1-mRNA對ASAP1表達的影響

綜上所述,本研究在乳腺癌組織和細胞水平分別驗證了ASAP1與腫瘤的轉移和增殖有相關性,提示ASAP1有望成為一類新的乳腺癌的腫瘤標志物和治療靶點,但值得注意的是HER2與ASAP1的表達卻無相關性,這可能與調控HER2表達和功能信號通路的復雜性和多樣性有關[9-12],說明病理診斷中聯合檢測HER2和ASAP1對乳腺癌的診斷、療效和預后有重要參考價值,HER2在乳腺癌轉移中的作用與ASAP1是否存在共同機制尚不清楚,目前的研究發現這兩種蛋白參與腫瘤轉移均與small GTPases家族相關[13-14],因此深入研究small GTPases在乳腺癌轉移中的作用,有可能發現調控HER2與ASAP1的共同靶點,將為乳腺癌的治療提供新的途徑。

參考文獻

[1]Bauvois B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers:outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Biochim Biophys Acta,2012,1825(1):29-36.

[2]Daniele A,Zito AF,Giannelli G,etal.Expression of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in sentinel lymph node and serum of patients with metastatic and non-metastatic breast cancer[J].Anticancer Res,2010,30(9):3521-3527.

[3]Fasching PA,Heusinger K,Haeberle L,etal.Ki67,chemotherapy response,and prognosis in breast cancer patients receiving neoadjuvant treatment[J].BMC Cancer,2011,11(486):1-13.

[4]Brand FX,Ravanel N,Gauchez AS,etal.Prospect for anti-her2 receptor therapy in breast cancer[J].Anticancer Res,2006,26(1B):715-722.

[5]Tolaney S.New HER2-positive targeting agents in clinical practice[J].Curr Oncol Rep,2014,16(1):359-364.

[6]Hou T,Yang C,Tong C,etal.Overexpression of ASAP1 is associated with poor prognosis in epithelial ovarian cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,7(1):280-287.

[7]Viticchiè G,Lena AM,Latina A,etal.MiR-203 controls proliferation,migration and invasive potential of prostate cancer cell lines[J].Cell Cycle,2011,10(7):1121-1131.

[8]Junnila S,Kokkola A,Karjalainen-Lindsberg ML,etal.Genome-wide gene copy number and expression analysis of primary gastric tumors and gastric cancer cell lines[J].BMC Cancer,2010,10(73):1-9.

[9]Lin D,Watahiki A,Bayani J,etal.ASAP1,a gene at 8q24,is associated with prostate cancer metastasis[J].Cancer Res,2008,68(11):4352-4359.

[10]黃前川,曹軍皓,季蒙.一類新的AP-2α轉錄共激活物Ku 70蛋白的鑒定[J].腫瘤防治研究,2009,36(8):631-634.

[11]黃前川,曹軍皓,丁進亞.RNAi干擾AP-2α對人乳腺癌細胞HER2表達及細胞增殖的影響[J].實用癌癥雜志,2009,24(4):345-347.

[12]Begon DY,Delacroix L,Vernimmen D,etal.Yin Yang 1 cooperates with activator protein 2 to stimulate ERBB2 gene expression in mammary cancer cells[J].J Biol Chem,2005,280(26):24428-

24434.

[13]Worzfeld T,Swiercz JM,Looso M,etal.ErbB-2 signals through Plexin-B1 to promote breast cancer metastasis[J].J Clin Invest,2012,122(4):1296-1305.

[14]Hashimoto A,Hashimoto S,Ando R,etal.GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin pathway frequently used in cancer invasion is activated by VEGFR2 to promote angiogenesis[J].PLoS One,2011,6(8):

e23359.

Study on the Expression of ASAP1 in Breast Cancers and Its Clinical SignificanceZHANGTinga,LIUWen-junb. (a.DepartmentofLaboratoryMedicine,b.DepartmentofPathology,HankouHospitalofWuhan,Wuhan430012,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of ADP ribosyl-factor GTP enzyme activator protein 1(ASAP1) in breast cancer,and explore the correlation between ASAP1 and breast cancer,in order to find new target in the treatment for breast cancer.MethodsA total of 41 patients with breast cancer admitted in Hankou Hospital from Jun.2010 to Jun.2013 were selected by simple random sampling,the expression levels of proliferating cell nuclear antigen(Ki67),matrix metalloproteinases-2(MMP-2),human epidermal receptor 2(HER2) and ASAP1 in breast cancer were detected by immunohistochemistry method in order to explore the correlation;the expression levels of HER2 and ASAP1 in mammary cancer cells with different invasiveness was detected by Western blot and compared;furthermore,the impact of siRNA on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was investigated，negative siRNA was added into the MDA-MB-231 cell culture system.Resluts Statistical analysss showed that HER2 expression had no correlation with ASAP1(P=0.803),and was significantly associated with Ki67 and MMP-2(P=0.035;P=0.013)；immunobloting assay demostrated that highly invasive breast cancer cells with a high level of ASAP1 and low unes with a weak ASAP1 expression (P<0.01),in contrast,no association between HER2 and ASAP1 was observed (P>0.05);expression of ASAP1 in MDA-MB-231 cells was repressed by siRNA,while expression level of VEGF was significantly lower than the control group(P<0.01).ConclusionExpressionofASAP1inbreastcanceriscorrelatedwiththeproliferationandmetastasisofthecancercells,therefore,ASAP1canbeatherapeutictargetinthetreatmentforbreastcancer.

Keywords：Breastcancer;ADPribosyl-factorGTPenzymeactivatorprotein1；ProliferatingcellnuclearantigenKi67；Matrixmetalloproteinase-2；Humanepidermalreceptor2

收稿日期：2014-04-24修回日期：2014-12-17編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.051

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-2057-03