CHC患者外周血T 細胞免疫功能與丙型肝炎病毒表達的關系＊

栗群英，梁明莉，陳 莉，吳麗娟，劉毓剛，劉 彤，謝 靜，胡宗海，曲遠青

（成都軍區總醫院實驗醫學中心／高濕醫學全軍重點實驗室，四川成都610083）

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的一種復雜的病理過程。中國普通人群抗-HCV 陽性檢出率達3.2%，約80%的HCV感染者發展為慢性肝炎，進行性肝臟損害、纖維化及肝硬化，15%發展為肝細胞癌，已嚴重危害人民的生命健康［1］。細胞免疫功能異?？赡苁窃斐刹《境掷m感染的主要原因之一，尤其是T 淋巴細胞數量和功能的異常［2］。但對雙陰性細胞（double negative T cell，DNT）和雙陽性細胞（double positive T cell，DPT）的研究國內相關報道尚少。本文對HCV 感染患者外周血T 淋巴細胞亞群、DNT、DPT 及血清中HCV-RNA、HCV 核心抗原（HCV-cAg）的檢測，探討CHC 患者的免疫功能改變，為臨床患者的發病機制、病情判斷、療效監測及防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2013年1月本院收治的CHC患者97例，診斷標準符合2000年（西安）全國第10次病毒性肝炎及肝病學術會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》［3］，排除自身免疫性疾病、艾滋病、梅毒及其他型肝炎患者12例，入選CHC 組85 例，男41 例，女44 例，年 齡19～80 歲，平 均52.87歲。根據HCV 感染者血清中HCV-cAg檢出模式分為2組，即HCV-cAg陰性組和HCV-cAg陽性組；根據HCV 感染者血清中HCV-RNA 載量水平，分為3 組，即RNA 陰性組（＜103copy／mL）、低拷貝組（103～104copy／mL）和高拷貝組（105～108copy／mL）。對照組為同期體檢人群中被證實的健康個體63例，所有納入者均無慢性疾病及1個月內無急性疾病，男33例，女30例，年齡1～77歲，平均48.00歲，性別及年齡與CHC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 儀 器 與 試 劑 T 淋 巴 細 胞 亞 群、DNT 及DPT 的 檢 測試劑包括同型對照抗體IgG1-FITC／IgG1-PE／IgG1-PC5、測定抗體CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、標本預處理試劑、鞘液等均為美國BECKMAN-COULTER 公司產品，儀器為美國BECKMAN-COULTER 公 司 XL4-MCL 型 流 式 細 胞 儀。HCV-cAg檢測試劑由山東萊博生物科技有限公司提供，儀器為上海熱電儀器公司生產Multiskan-Mk3型酶標儀及上海新波公司EGATE2310型洗板機。HCV-RNA 檢測試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供，儀器為該公司的DA7600型核酸擴增儀。

1.2.2 流式T 淋巴細胞亞群檢測 以乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管（紫頭真空采血管）采集患者靜脈血約2 mL，立即檢驗；采用雙平臺法三色流式細胞術、SSC／FSC 設門淋巴細胞，分析總T 細胞（CD3＋）、T4細胞（CD3＋CD4＋）、T8細胞（CD3＋CD8＋）、DNT（CD3＋CD4―CD8―）、DPT（CD3＋CD4＋CD8＋）、NK 細胞（CD3＋CD16＋CD56＋）的水平和絕對值，并計算T4／T8 細胞比值。具體檢測方法見參考文獻［4］執行。

1.2.3 抗-HCV、HCV-cAg 及HCV-RNA 載量檢測 采用ELISA 法檢測抗-HCV、HCV-cAg；采用熒光定量PCR 法檢測HCV-RNA 載量，均嚴格按照試劑說明書步驟進行。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS18.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組對象外周血T 細胞亞群水平的比較 與對照組比較，CHC組患者T8細胞比例明顯減少（P＜0.01），T4／T8比值升高（P＜0.01）；總T 細胞、T4細胞、T8細胞和DNT 絕對值明顯減少（P＜0.01），見表1、2。

表1 兩組對象外周血T 細胞亞群水平比較（±s，%）

表1 兩組對象外周血T 細胞亞群水平比較（±s，%）

a：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n 總T 細胞 T4細胞 T8細胞 T4／T8 DNT DPT對照組 63 68.94±6.01 35.13±4.86 25.64±3.76 1.35±0.25 7.20±2.62 0.15±0.17 CHC組 85 67.37±10.43 37.11±10.28 21.63±8.87a 2.18±1.26a 7.80±4.57 0.20±0.29

表2 兩組對象外周血T 細胞亞群絕對值比較（±s）

表2 兩組對象外周血T 細胞亞群絕對值比較（±s）

a：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n 總T 細胞（×109／L） T4細胞（×109／L） T8細胞（×109／L） DNT（×109／L） DPT（×107／L）.22±0.27 CHC組 85 0.70±0.44a 0.37±0.22a 0.22±0.17a 0.08±0.06a對照組 63 1.14±0.43 0.57±0.22 0.44±0.18 0.13±0.07 0 0.19±0.68

表3 各組血清不同HCV-cAg檢出模式及其外周血T 細胞亞群水平比較（±s，%）

表3 各組血清不同HCV-cAg檢出模式及其外周血T 細胞亞群水平比較（±s，%）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對照組比較；c：P＜0.05，與RNA 陰性組比較；d：P＜0.05，e：P＜0.01，與HCV-cAg陽性組比較。

組別 n 總T 細胞 T4細胞 T8細胞 T4／T8 DNT DPT對照組 63 68.94±6.01 35.13±4.86 25.64±3.76 1.35±0.25 7.20±2.62 0.15±0.17 HCV-cAg陰性組 65 67.71±10.54 36.78±10.59 21.42±9.25b 2.18±1.38b 7.46±4.21 0.22±0.32 HCV-cAg陽性組 19 66.46±10.49 38.29±9.62a 18.02±7.37b 2.22±0.80b 9.06±5.71a 0.16±0.11 RNA 陰性 組 23 65.32±9.64a 37.64±11.48 18.04±7.53b 2.56±1.56b 7.00±3.70 0.16±0.13低拷貝組 17 66.71±9.59 39.01±11.15a 20.82±9.50bd 2.39±1.50b 6.98±5.66d 0.36±0.53be高拷貝組 30 68.61±10.01 37.67±7.48a 21.87±7.60bd 1.86±0.76bcd 8.16±4.50d 0.17±0.21

表4 各組血清不同HCV-cAg檢出模式及其外周血淋巴細胞亞群絕對值比較（±s）

表4 各組血清不同HCV-cAg檢出模式及其外周血淋巴細胞亞群絕對值比較（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對照組比較；c：P＜0.05，與RNA 陰性組比較；d：P＜0.05，與HCV-cAg陽性組比較。

組別 n 總T 細胞（×109／L）T4細胞（×109／L） T8細胞（×109／L） DNT（×109／L） DPT（×107／L）.22±0.27 HCV-cAg陰性組 65 0.69±0.45b 0.37±0.23b 0.22±0.18b 0.08±0.07b 0.21±0.78 HCV-cAg陽性組 19 0.72±0.41b 0.37±0.20b 0.20±0.12b 0.09±0.05a 0.11±0.16 RNA 陰性 組 23 0.72±0.41b 0.37±0.20b 0.20±0.12b 0.09±0.05a 0.11±0.16低拷貝組 17 0.84±0.56acd 0.48±0.32bcd 0.23±0.17bd 0.08±0.08a 0.51±0.14高拷貝組 30 0.77±0.45bcd 0.39±0.20bd 0.26±0.18bcd 0.09±0.06b 對照組 63 1.14±0.43 0.57±0.22 0.44±0.18 0.13±0.07 0 0.17±0.35

2.2 各組對象不同HCV-cAg檢出模式及其外周血T 細胞亞群的比較 與對照組比較，HCV-cAg陰性組和HCV-cAg陽性組的T8細胞水平及絕對值均明顯減少（P＜0.01），T4／T8比值均明顯升高（P＜0.01）；總T 細胞、T4 細胞、T8 細 胞 和DNT 的絕對值均明顯減少（P＜0.05）；HCV-cAg 陽性組和HCV-RNA 陽性高拷貝組，T4 細胞及DNT 水平均顯著增加（P＜0.05）；RNA 陰性組，低拷貝組和高拷貝組的T8細胞水平及絕對值均明顯減少（P＜0.01），T4／T8 比值均明顯增加（P＜0.01），總T 細胞、T4細胞和DNT 的絕對水平均顯著減少（P＜0.05）。85 例CHC 患者中，1 例未檢測HCV-cAg，15例未檢測HCV-RNA。見表3、4。

3 討 論

HCV 感染引起機體細胞免疫系統改變是醫學界關注的熱點，T 淋巴細胞作為機體主要免疫細胞在HCV 感染中所起的作用更是倍受國內外學者青睞。HCV 感染機體導致CHC 發生，引起體內T 細胞免疫功能改變，探討T 細胞變化與體內HCV 表達之間的關系，對于CHC 治療流程的建立尤為重要。研究證實，病原體進入機體后將引發一系列的免疫效應，免疫效應主要是由T 細胞不同亞群發揮功能而實現。正常情況下，T4和T8細胞相互誘導、相互制約，形成T 細胞網絡以調節免疫功能和維持免疫穩態，任何一種T 細胞亞群的水平改變，都將導致免疫功能狀態的改變［5-6］。

HCV 感染引起患者細胞免疫應答中，T4細胞、T8細胞及DNT 都起著重要的作用。目前一般認為T4細胞主要對HCV抗原產生應答，激活的T4細胞以釋放IL-2，促進B 細胞分化產生相應抗體抵御HCV 的入侵［7］；T8 細胞主要作用是清除感染病毒，但是執行清除任務是對被感染的靶細胞和病毒一起執行清除處理的，因而在清除病毒的同時會造成肝細胞損傷，為引起肝臟炎癥的主要淋巴細胞［8］；DNT 是近年來新發現的一群免疫調節性T 細胞，具有免疫抑制功能，通過清除同種同源性T8細胞和產生白細胞介素4（IL-4）和IL-10等途徑發揮抑制性免疫調節作用［6］。

本研究顯示，CHC患者外周血的T8 細胞水平及總T 細胞、T4 細胞、T8 細胞和DNT 的絕對值均明顯低于對照組（P＜0.01），T4／T8比值則明顯高于對照組（P＜0.01）。CHC患者T8細胞比例下降，不利于產生強的特異性細胞病毒T 淋巴細胞反應，提示特異性抗病毒免疫功能不能達到有效地清除病毒的水平，造成病毒持續復制，病情遷延，同時加重了丙型肝炎慢性化趨勢，與金波等［9］的報道一致。本研究中，根據CHC患者血清HCV-cAg檢出不同模式，對病毒與細胞免疫功能變遷之間的關系進行了調查，發現HCV-cAg陽性組T4細胞及DNT 所占比例明顯高于對照組（P＜0.05），提示血液中DNT細胞異常增高可能參與CHC 的發生、發展過程，與梁騎等［10］的報道一致。本研究推測DNT 細胞升高旨在抑制T8細胞，使機體殺病毒細胞免疫功能降低，導致病毒持續感染（感染慢性化），患者病情加重；另一原因可能是感染HCV 后，T8細胞聚集肝組織殺病毒導致血液中的T8 細胞急劇減少，DNT 加速增生對T8細胞減少進行補償。但是，對慢性HCV 感染者而言，截至目前DNT 升高的確切作用與機制仍然不明?？紤]到HCV-cAg是HCV 感染者體內出現的早期感染性標志［11］，HCV-cAg陽性檢出可能是HCV 反復感染的原因之一。本文進一步研究了病毒復制程度與細胞免疫功能的關系，發現低拷貝組的T4細胞及DPT 所占比例明顯高于對照組（P＜0.01），提示DPT 的異常表達可能參與CHC 的發生、發展過程，與Nascimbeni等［12］關于HCV 感染者往往有DPT 在血液和肝臟中比例升高的報道一致，推測DPT 在T 淋巴細胞中的比例增高與DNT 增高原因相同，但DPT 增高的確切作用機制目前仍然不清。低拷貝組和高拷貝組與RNA 陰性組T 細胞亞群絕對值比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但前二者比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明CHC 患者的免疫功能與血清HCV-RNA 的表達有顯著相關性，而與病毒載量水平高低無相關性，因此CHC患者血清HCV-RNA 表達可能是HCV 持續感染和免疫耐受的重要原因之一。張武英等［13］則認為CHC患者HCV-RNA 的表達水平升高，可能是導致T 淋巴細胞應答能力下降的重要原因。而HCV-RNA 高表達和低表達的CHC患者均較HCV-cAg陽性的CHC患者T8細胞下降幅度更低，這可能提示HCV 反復感染較HCV-RNA 拷貝數對T8抑制作用更明顯，更易導致慢性化。在大多數HCV 感染慢性化患者中，HCV-RNA 水平降低是逐漸呈現的，最后趨于穩定，晚期患者HCV-RNA 水平很低，甚至無法測出來；HCV-RNA易被血細胞中的RNA 酶降解，如果被檢標本保存不當（例如反復凍融）也將出現陰性檢測結果；HCV-RNA 還受進食的影響，易與血中脂質及脂蛋白結合，降低檢出率［11］。

綜上所述，HCV 感染可導致感染者細胞免疫功能改變，CHC患者HCV 感染后在體內表達程度不同，其T 淋巴細胞各亞群存在的紊亂程度也不同；HCV-cAg 陽性檢出可能是HCV 反復感染的原因之一，HCV-RNA 表達可能是HCV 持續感染和免疫耐受的重要原因之一，而HCV 持續感染是丙型肝炎遷延不愈的重要原因［14］；HCV 反復感染和持續感染患者的淋巴細胞亞群發生變化，加重了丙型肝炎的慢性化。流式細胞學技術檢測T 淋巴細胞亞群有助于臨床CHC 患者的診斷、病情判斷及療效監測。

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