細胞因子信號轉導抑制因子3在早產胎盤中的表達及臨床意義

溫　娜,張巧玉,王振國

(解放軍第三〇九醫院婦產科，北京 100091)

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細胞因子信號轉導抑制因子3在早產胎盤中的表達及臨床意義

溫娜,張巧玉,王振國※

(解放軍第三〇九醫院婦產科，北京 100091)

摘要：目的探索細胞因子信號轉導抑制因子3在早產胎盤中的表達及臨床意義。方法選取2013年4~10月解放軍第三〇九醫院收治的20例早產婦女作為實驗組，20例足月妊娠婦女作為對照組，收集兩組胎盤組織。應用Western blot法檢測兩組胎盤組織中SOCS3分子的表達水平，采用免疫組織化學法檢測兩組細胞因子白細胞介素(IL)10、腫瘤壞死因子(TNF)α的表達水平。比較2種因子在兩組胎盤中的差異表達情況。結果與對照組相比，實驗組胎盤組織中SOCS3陽性表達量明顯增高(1.09±0.29比0.81±0.22，P<0.05)，IL-10陽性表達率明顯高于對照組(85.0%比45.0%；P<0.05)，而實驗組TNF-α表達陽性率則明顯降低(25.0%比70.0%，P<0.05)。結論SOCS3及IL-10在早產胎盤中表達較高，相反TNF-α表達降低，其是可能SOCS3是通過對Th1/Th2的平衡調節，導致了早產的發生重要原因之一。

關鍵詞：早產；細胞因子信號轉導抑制因子3；白細胞介素10；腫瘤壞死因子α

早產兒身體功能發育相對不完善，其出生后生存能力低、病死率高，目前有研究顯示75%以上的圍生兒死亡與早產有關[1]。因此如何早期發現預警早產、干預早產是值得深入研究的課題，研究表明細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)在免疫調控中作用突出，其通過影響細胞因子的相互調節作用導致Th1/Th2平衡改變，從而影響妊娠結局[2-3]。因此，本研究通過分析SOCS3在早產胎盤與足月胎盤中的表達情況，進一步探索SOCS3在早產胎盤中的表達及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年4~10月解放軍第三〇九醫院收治的早產婦女20例作為實驗組，20例足月妊娠婦女作為對照組。早產組納入標準按第6版《婦產科學》標準[4-5]執行，對照組為無產科并發癥及內科合并癥，以獲取兩組婦女妊娠后的胎盤組織作為研究材料。其中實驗組婦女年齡20～37歲，平均(28.6±3.7)歲；孕周28～35周，平均(32.3±1.4)周。對照組婦女年齡20～38歲，平均(26.8±2.8)歲；孕周37～41周，平均(39.7±0.5)周。

1.2納入與排除標準①平素月經規律，無甲狀腺功能異常及糖尿病等內分泌疾病，無其他慢性全身性疾病，無有害有毒物質及放射線接觸史；②夫婦雙方染色體G顯帶核型分析正常；③經婦檢、陰道超聲等檢查排除生殖系統解剖結構異常；④抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體檢測陰性，優生4項檢測陰性；⑤白帶化驗正常，支原體、衣原體檢測陰性，排除生殖道感染。此實驗方案已通過本院倫理委員會的審查，兩組孕婦均簽署知情同意書，同意并支持此次樣本的采集。

1.3樣本采集兩組孕婦在胎盤娩出后10 min內在臍輪正對面(本研究并不涉及胎盤各區域的差異性，選取臍輪正對面只為方便定位同位置，以降低胎盤各區域差異性帶來的誤差)剪取2 cm×1 cm×1 cm組織，均分兩份，0.9%氯化鈉溶液漂洗后，一份置于-80 ℃冰箱凍存，一份置于4%甲醛溶液固定。

1.4試劑Western Breeze試劑盒，BCA法蛋白定量試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，二步法免疫組織化學檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)凝膠制備試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，內參β-actin(北京中杉金橋生物技術有限公司)，WIP組織細胞裂解液(北京博奧森生物技術有限公司)，彩色預染中分子蛋白質分子量標準(武漢博士德生物工程有限公司進口分裝)，SOCS3(h-103)(SANTA CRUZ Biotechnology,Inc.)，Bio-Rad電泳儀，電轉儀酶標儀，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物技術有限公司)，白細胞介素(interleukin,IL)10 Rabbit Anti、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)Rabbit Anti(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白上樣緩沖液(上海新銳生物科技有限公司)。

1.5Western blot檢測各組中SOCS3蛋白表達情況取-80 ℃凍存胎盤組織，研磨裂解提蛋白，按照BCA試劑盒操作說明測定蛋白水平，蛋白變性備用。制作聚丙烯酰胺凝膠，按每泳道50 μg蛋白量上樣，電泳分離轉膜，110 V恒壓轉膜50 min，封閉液常溫封存1 h，加入SOCS3多克隆抗體孵育，置4 ℃冰箱8 h，添加Western Breeze二抗，37 ℃恒溫孵育2 h，堿性磷酸酶法顯色30 min，β-actin作內參對照，凝膠圖像采集系統采集圖像，目的蛋白/β-actin灰度值表示蛋白的相對表達水平。

1.6免疫組織化學檢測通過免疫組織化學檢測IL-10及TNF-α在各組胎盤組織的表達情況：甲醛固定24 h后標本用乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明處理后石蠟包埋。根據免疫組織化學試劑盒(上海澤邁生物技術有限公司)提供的步驟進行。高倍鏡下細胞內出現棕黃顆粒為陽性表達，每張切片在高倍鏡下選取3個連續不重復的視野，利用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件進行的定位、定量，采用顯色輕度與陽性細胞百分率法相結合判讀結果。每例最后得分為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為(-)，1~4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。結果判斷在雙盲下進行，每張切片由兩名高年資病理科醫生分別計數[2]。

2結果

2.1SOCS3在胎盤組織的表達情況實驗組胎盤組織中SOCS3的陽性細胞表達量為1.09±0.29，對照組表達量為0.81±0.22，實驗組胎盤組織SOCS3的陽性表達量明顯升高(t=10.21，P<0.05)，見圖1。

圖1對照組和實驗組細胞因子信號轉導抑制因子(SOCS3)蛋白表達情況比較對照組：足月妊娠婦女胎盤；實驗組：早產婦女胎盤

2.2IL-10、TNF-α在各組胎盤組織的表達情況IL-10在實驗組中陽性表達率為85.0(17/20)，顯著高于對照組的45.0%(9/20)，差異有統計學意義(χ2=4.286，P<0.05)，實驗組IL-10陽性表達強度較對照組高(Z=4.462,P<0.01)；TNF-α在實驗組中陽性表達率為25.0%(5/20)，顯著低于對照組的70.0%(14/20)，差異有統計學意義 (χ2=8.120，P<0.01)，實驗組TNF-α陽性表達強度較對照組低(Z=2.795,P<0.01)。見表1。

表1　兩組胎盤組織中IL-10、TNF-α的陽性表達情況比較　(例)

IL-10：白細胞介素10；TNF-α：腫瘤壞死因子α；實驗組：早產婦女;對照組:足月妊娠婦女

3討論

生殖免疫學認為，妊娠是一種成功的同種異體移植現象，正常妊娠的維持有賴于妊娠母體對胚胎半同種抗原的免疫耐受，此種免疫調節不僅發生在母體的全身免疫系統，而且也發生在妊娠子宮的局部，局部免疫更直接影響著胚胎的著床、發育，在維持正常人身中起重要作用，這種耐受一旦被破壞，則導致病理妊娠，如流產、早產等[3-4]。輔助性T淋巴細胞分為Th1和Th2亞群，Th1型細胞分泌TNF-α、IL-2、干擾素γ，介導細胞免疫應答；Th2型細胞分泌IL-10、IL-4、IL-6等，介導體液免疫應答。研究發現，在母胎界面SOCS3主要表達在Th2型細胞中并抑制Th1型細胞因子的分泌，抑制Th1型細胞因子的免疫反應，維持Th2占優勢的Th1/Th2平衡[4-5]。這種平衡是保持母體對胚胎免疫耐受的關鍵因素，決定著妊娠的結局[6-7]。IL-10作為Th2型細胞因子是重要的抗炎性因子，妊娠時IL-10可直接抑制母胎界面的自然殺傷細胞，抑制TNF-α、IL-2等Th1型細胞因子反應，并且通過抑制一氧化氮生成來抑制巨噬細胞，相應減少胎兒、胎盤的血液循環，從而間接抑制母體對胚胎的免疫排斥[8-9]。

本實驗研究了SOCS3、IL-10、TNF-α在早產胎盤及正常妊娠胎盤組織中的表達情況，結果顯示，實驗組SOCS3表達量顯著高于對照組，IL-10陽性表達強度較對照組高，而TNF-α陽性表達強度較對照組低，說明3種因子的差異表達與早產確實存在關聯性。IL-10在兩組胎盤組織中均有表達，但實驗組顯著高于對照組，也支持SOCS3高于正常的實驗結果，說明胎盤界面SOCS3的高表達，從而導致IL-10過表達，以此打破了母胎界面Th1/Th2平衡，從而導致早產的發生。TNF-α作為Th1型細胞因子，是重要的炎癥和免疫調節因子。生理情況下，適量的TNF-α可調節滋養層細胞的正常增殖、分化和凋亡，促進胚胎發育，對妊娠的維持具有重要作用。TNF-α的分泌受Th2型細胞因子IL-10、IL-4等抑制，本研究結果顯示，實驗組TNF-α陽性率低于正常組，支持早產患者胎盤SOCS3表達高于正常以及IL-10高于正常的實驗結果。

SOCS3作為細胞因子信號轉導抑制因子SOCS家族中的重要成員，是現階段此家族成員中研究最為廣泛和深入的一種。SOCS3可表達于多種細胞中，目前研究證實其主要通過以下3種途徑影響細胞因子的信號轉導：①通過抑制JAK激酶活性阻斷JAK-STAT通路[9]；②與細胞因子受體結合，阻斷STAT活性；③通過增加蛋白酶體的活性，加速JAK-STAT途徑信號蛋白的水解[10-12]；SOCS3通過以上機制影響IL、TNF、干擾素等多種細胞因子的信號轉導，并在T細胞的分化和免疫調控中扮演重要角色，是機體固有免疫和獲得性免疫的重要調節因子。但在本研究中對不同T細胞因子的表達情況進行分析，證明Th1/Th2平衡破壞在早產中的重要作用，進一步豐富了生殖免疫理論，同時通過此研究結合既往SOCS3相關信號通路研究結果，可以大膽推測其相關的信號轉導途徑，為將來進一步深入研究早產機制奠定了新的理論基礎,為預警及預防早產提供了實驗室參考。

綜上所述，SOCS3參與早產的發生，其影響機制可能是影響細胞因子，調劑T細胞平衡，通過IL-10高表達，同時多于生理量的SOCS3、IL-10抑制TNF-α的表達，導致TNF-α水平過低，破壞母胎界面Th1/Th2免疫平衡狀態，導致早產的發生。研究表明，SOCS3在導致早產發生的過程中作用越來越明顯[13]，但是仍有許多機制尚未不清楚，需要進一步研究證實。

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Expression of SOCS3 and Its Significance in Preterm PlacentaWENNa,ZHANGQiao-yu,WANGZhen-guo.(DepartmentofGynecologyandObstetrics,PLA309thHospital,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of suppressor of cytokine signaling (SOCS3) and its significance in preterm placenta.MethodsRetrospective analysis was made on 20 patients(observation group) who had spontaneous preterm labor and 20 pregnant women(control group) with normal delivery during the same period,the patients were from PLA 309th Hospital during Apr. 2013 and Oct. 2013.The expression of SOCS3 in placenta were examined by Western blot,the expression of interleukin (IL)-10 and tumor mecrosis factor α (TNF-α) was detected by immunohistochemical method.The differences of expression of SOCS3,IL-10,TNF-α were compared.ResultsCompared with normal delivery，the expression of SOCS3 and IL-10 were significantly increased in placenta with preterm birth(SOCS3:1.09±0.29 vs 0.81±0.22, P<0.05; IL-10:85.0% vs 45.0%,P<0.05),and expression of TNF-α was significantly decreased in placenta with preterm birth(25.0% vs 70.0%,P<0.05).ConclusionThe expression of SOCS3 and IL-10 were increased and TNF-α was decreased in placenta with preterm birth,and SOCS3 may influence the Th1/Th2 balance and is one of the important causes leading to preterm birth.

Key words:Preterm birth; Suppressors of cytokine signaling 3; Interleukin-10； Tumor necrosis factor α

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-02-27編輯：相丹峰

基金項目：解放軍第三〇九醫院課題(2013MS-012)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.048

中圖分類號：R714.7

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3394-03