紫錐菊提取物對大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特異性免疫功能的影響*

秦志華 董文賓 姜令緒 王仁杰 張啟迪單 虎 ① 雷霽霖

(1. 青島農業大學 青島 266109; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是中國北方沿海地區的重要海水養殖品種, 但是隨著水產養殖業不斷發展, 特別是集約化、規?；潭鹊牟粩嗵岣? 給魚類疾病防治提出了新的挑戰。在養殖生產過程中由于抗生素等藥物的不正當使用, 不僅使病原微生物產生抗藥性, 耐藥菌株不斷增加, 水產動物免疫功能下降, 同時也造成了巨大的經濟損失, 如“多寶魚藥殘事件”使整個大菱鲆產業受到了沉重打擊。因此,如何提高大菱鲆的健康養殖水平, 促進大菱鲆養殖業的可持續健康發展, 成為當前的首要任務。

中草藥作為免疫增強劑符合發展無公害漁業、生產綠色水產品的需求。國內外很多研究證明, 中草藥免疫增強劑可顯著增強水產動物的抗病能力。國外學者以單方中草藥牛膝和旱蓮草分別投喂露斯塔野鰻和羅非魚, 結果表明能顯著提高機體的免疫力(Rao et al, 2005; Christybapita et al, 2007)。國內學者用復方中草藥投喂羅非魚(張照紅等, 2011)、牙鲆(李霞等,2011)、草魚(李超等, 2011)等, 均能有效地提高機體非特異性免疫力。在我國, 紫錐菊作為非傳統中草藥,近幾年的研究越來越多, 但在水產養殖中的研究較少。僅有任永林(2008)關于紫錐菊對鯉魚的生產性能和免疫功能的影響研究。

大菱鲆是近年來推廣的養殖品種, 有關紫錐菊對它的作用效果尚未見報道。本研究通過給大菱鲆注射不同濃度的紫錐菊提取物, 測定其非特異性免疫指標以及機體的抗病力, 研究其對大菱鲆的免疫效果, 進而為其在大菱鲆養殖生產過程中推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藥物紫錐菊提取物(有效成分為5.4%菊苣酸)由青島市康地恩藥業有限公司提供。試驗用魚購買于膠南通用水產有限公司。

1.2 試驗設計

試驗用魚分為 4個組, 對照組(注射生理鹽水),低劑量組(10mg/mL)、中劑量組(20mg/mL)、高劑量組(40mg/mL), 每組10尾魚, 每組設4個重復。

1.3 試驗動物及飼養管理

試驗大菱鲆體重 250±20g, 以重復為單位飼養于水循環室內, 保持水溫在 14—15 °C之間。鹽度為31—33, pH為7.8—8.3, 24h不間斷充氧, 馴化及試驗期間足量投喂基礎飼料, 定時除去殘餌。進行為期7d馴化, 再進行28d試驗。

每天上午10點對大菱鲆注射不同濃度的紫錐菊0.2mL, 觀察大菱鲆的攝食量、精神活動狀態并記錄。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品采集 在試驗過程中的7、14、21、28d分別對各組大菱鲆取樣(n=12), 取樣前 1h停止注射紫錐菊提取物。分別用無菌采血器從大菱鲆尾靜脈中抽血, 每尾采血樣1.0mL, 其中10尾的血液置于離心管中, 通過凍融法破碎細胞, 在3000r/min, 離心15 min,取血清進行溶菌酶活力和超氧化物歧化酶活力的測定。

在注射試驗的第28天對各組大菱鲆取樣(n=10),取樣前1h停止注射紫錐菊提取物。分別從尾靜脈中采血, 每尾采血樣 1.0mL, 進行體外細胞培養, 測定呼吸爆發活力。

1.4.2 溶菌酶活力測定 根據王雷等(1994)的方法略做修改, 用0.067mo1/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)將溶壁微球菌配制成 0.2mg/mL的菌懸液, 每個樣品取 3mL菌懸液, 加入 40μL血清, 混勻后立即在540nm下測定反應液的吸光值 A, 然后在 28°C水浴中放置 30min, 立即取出轉入 4°C冰浴以中止反應,再在540nm下測定B值。按公式計算溶菌酶的活力U= (B–A)/B 。

1.4.3 吞噬細胞吞噬活力的測定 參照劉紅等(2006)的方法, 在0.5mL抗凝血中加入0.2mL遲緩愛德華氏菌(含菌量 1×108CFU/mL), 置于 25°C 培養箱中振蕩培養1h, 3000r/min離心15min, 取沉淀底層物抹片, 甲醇固定 5—10min, 瑞氏染色 30s, 姬母薩氏染色10 min, 蒸餾水沖洗, 吹干。在油鏡下觀察100個吞噬細胞的吞噬情況, 計數并計算吞噬細胞的吞噬百分比(PP)。

1.4.4 超氧化物歧化酶活性的測定 SOD活力的測定采用連苯三酚自氧化法(鄧碧玉等, 1991), 以每毫升反應液中, 每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個活力單位。

1.4.5 大菱鲆原代細胞的培養 在大菱鲆肌肉注射紫錐菊提取物溶液后的第4周取樣。取樣之前魚禁食 24h。從每個處理隨機選取6尾魚, 重擊魚的頭部使其昏迷, 解剖分離頭腎, 迅速轉移到 L-15 培養基中(含有1%雙抗和2%血清) 。在無菌條件下, 用100目篩絹將頭腎組織研磨成細胞懸液, 用51%的percoll溶液在 2200r/min下進行離心 30min, 以分離巨噬細胞, 并用血細胞計數器檢測細胞存活數, 將細胞濃度調整至 107個/mL。在 96孔板的每孔加入 100μL 調好濃度的頭腎巨噬細胞于18°C下培養2h (Ortu?o et al, 2000)。

1.4.6 呼吸爆發活力的測定 實驗方法參考Dolmatova(2004)的方法并略作改動。在96孔板培養的貼壁巨噬細胞懸液去掉上清液后, 在每孔中加入100μL的1mg/mL氯化硝基四氮唑藍溶液(NBT), 18°C下孵育2h。棄去上清液, 再加入200μL 100%的甲醇固定巨噬細胞, 室溫反應10min后, 再用70%的甲醇溶液洗 2次, 然后將 96孔板自然風干。風干后在每孔中加入120mL 2mol/L的 KOH和140μL的二甲基亞砜(DMSO)。用振蕩器緩慢振蕩5min后, 室溫下在620nm波長處測定吸光度值。

1.5 攻毒試驗

注射試驗28d后進行攻毒試驗, 攻毒試驗每組10尾魚, 共4組。試驗用遲緩愛德華氏菌由中國水產科學研究院黃海水產研究所提供, 預試驗確定攻毒濃度為1 × 108CFU/mL, 每尾注射0.2mL, 連續觀察7d,統計每組的死亡率, 計算免疫保護率。

1.6 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析,進行Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 肌肉注射紫錐菊提取物對大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

如圖 1所示, 注射 7、15、21、28d紫錐菊提取物對大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05),與其它兩個劑量組差異極顯著(P＜0.01), 低劑量組與空白對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 紫錐菊提取物對大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響Fig.1 Effects of E. purpurea extract on superoxide dismutase(SOD) activity of turbot

2.2 肌肉注射紫錐菊提取物對大菱鲆溶菌酶(LSZ)活力的影響

如圖 2所示, 注射 7、15、21、28d后紫錐菊提取物對大菱鲆溶菌酶活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05), 而與其它兩個劑量組差異極顯著(P＜0.01), 低劑量組與空白對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 紫錐菊提取物對大菱鲆溶菌酶活力的影響Fig.2 Effects of E. purpurea extract on turbot lysozyme activity

2.3 肌肉注射紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞呼吸爆發活力的影響

圖3所示, 注射28d后紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞的呼吸爆發活力的影響極顯著(P＜0.01), 高劑量組與空白組差異極顯著(P＜0.01), 而與其它兩個劑量組差異不顯著(P＞0.05), 低劑量組和中劑量組與空白對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 注射紫錐菊提取物28d對大菱鲆吞噬細胞呼吸爆發活力的影響Fig.3 Effects of injection of E. purpurea extract 28d on turbot phagocytic respiratory burst activity

2.4 肌肉注射紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞吞噬率(PP)的影響

圖 4所示, 注射 15d、28d后紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞的吞噬活力的影響顯著(0.01＜P＜0.05),高劑量組與其它 3個試驗組差異顯著(0.01＜P＜0.05),低劑量組和中劑量組與空白對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞吞噬率的影響Fig.4 Effects of E. purpurea extract on phagocyte phagocytosis rate of turbot

2.5 攻毒試驗

從表 1中看出肌肉注射射紫錐菊提取物能顯著提高大菱鲆的免疫保護率, 其中高劑量組與中劑量組差異不顯著(P＞0.05)。高劑量組、中劑量組與低劑量組、空白對照組差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

3.1 紫錐菊提取物對大菱鲆溶菌酶和吞噬細胞吞噬活力的影響

魚類由于其特異性免疫機制尚不完善, 非特異性免疫在其防御體系中具有重要作用。其中溶菌酶和吞噬細胞在魚類抵抗各種病原微生物中發揮重要作用。溶菌酶是存在于溶酶體內的水解酶, 是吞噬細胞殺菌的物質基礎和重要的非特異性免疫因子, 能使吞噬細胞的吞噬活性增強(Amar et al,2004; 孟小亮等, 2009)。因此, 通過測定魚類血液中吞噬細胞吞噬能力以及血清中的溶菌酶活性, 可以從一定程度上衡量魚類非特異性免疫力(劉勇等,2007)。徐歆(2014)研究表明, 紫錐菊提取物能夠能夠通過增強小鼠機體的抗體分泌和非特異性免疫,來增強機體的免疫功能, 并且能夠提高小鼠抗沙門氏菌感染的能力。紀簡常等(2002)研究表明, 中草藥能顯著提高建鯉的溶菌酶活力。本研究表明, 紫錐菊提取物能顯著的提高大菱鲆溶菌酶活力, 整個試驗過程, 高劑量組與中劑量組對溶菌酶活力提升比較顯著, 低劑量組對溶菌酶活力的影響不顯著,而高劑量紫錐菊提取物對吞噬細胞吞噬活力影響比較顯著, 其它劑量組不是很顯著, 綜上所述, 紫錐菊提取物能有效的提高大菱鲆的非特異免疫因子的活力。

表1 攻毒后的死亡率和免疫保護率Tab.1 The survival rate and relative percent survival rate after challenged by E. tarda

3.2 紫錐菊提取物對大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

超氧化物歧化酶是生物體內抗氧化酶系的重要酶類, 對生物體內活性氧自由基的清除起著至關重要的作用, 檢測抗氧化指標可以反映機體的抗氧化能力和免疫情況。研究表明, 紫錐菊提取物對能顯著的提高大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力, 注射到第7天時, 高劑量組與中劑量組對超氧化物歧化酶(SOD)活力提升比較顯著, 低劑量組沒有顯著變化,隨著試驗的進行, 注射 15、21、28d, 高劑量組對超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響弱于中劑量組, 但是差異不是很顯著。說明紫錐菊提取物在短時間內對大菱鲆的超氧化物歧化酶(SOD)活力維持在一個比較高的水平。陳孝煊等(2003)用 1%金銀花的飼料喂養異育銀鯽, 血清中 SOD的活性增強, 這與本試驗的研究結果類似。

3.3 肌肉注射紫錐菊提取物對大菱鲆吞噬細胞呼吸爆發活力的影響

吞噬細胞的呼吸爆發活力功能在宿主防御及炎癥反應中起著重要的作用, 在吞噬過程或受刺激產生呼吸爆發, 消耗氧氣釋放大量活性氧自由基(邢宇坤等, 2004)。呼吸爆發增強后能增加氧化水平以此來刺激吞噬細胞, 在魚類非特異性免疫中被認為是一個重要的指標(Miyazaki, 1998), 注射28d后測試表明高劑量組顯著的提高大菱鲆吞噬細胞呼吸爆發活力,而其它劑量組沒有顯著變化。說明隨著紫錐菊提取物濃度的提高, 對大菱鲆吞噬細胞呼吸爆發活力也有所增強。

3.4 攻毒試驗

攻毒試驗結果顯示, 高劑量組對大菱鲆的免疫保護率最高, 中劑量組次之, 低劑量組較差, 結合對大菱鲆的非特異性免疫指標的測定, 基本符合試驗預期結果。說明紫錐菊提取物能顯著的提高大菱鲆非特異性免疫力及機體抗病力。

4 結論

本試驗研究了紫錐菊提取物對大菱鲆非特異性免疫力的影響。結果表明, 紫錐菊提取物可提高大菱鲆魚體非特異性免疫功能, 增強抗病力。因此, 將紫錐菊提取物應用為大菱鲆免疫刺激劑具有廣闊的前景。但是, 紫錐菊提高魚體免疫力的機理還不甚清楚,不同濃度紫錐菊提取物對大菱鲆免疫力的影響也有待于進一步研究。

王 雷, 李光友, 毛遠興等, 1994. 口服免疫型藥物對養殖中國對蝦病害防治作用的研究. 海洋與湖沼, 25(5): 486—492

鄧碧玉, 袁勤生, 李文杰等, 1991. 改良的連苯三酚自氧化測定超氧化物歧化酶活性的方法. 生物化學與生物物理進展, 18(2): 163

刑宇坤, 張 偉, 2004. 中性粒細胞呼吸爆發的產生機制及其炎癥效應. 基礎醫學與臨床, 24(1): 1—6任永林, 2008. 紫錐菊提取物對鯉生產性能和免疫功能的影響.雅安: 四川農業大學碩士學位論文

劉 勇, 賈永紅, 2007. 免疫增強劑對河鯽魚白細胞吞噬和溶菌酶活性的影響. 安徽農業科學, 35(1): 111—113

劉紅柏, 盧彤巖, 張春燕等, 2006. 黃芪對史氏鱘抗氧化能力及免疫力的影響. 大連水產學院學報, 21(3): 231—235

李 超, 張其中, 楊瑩瑩等, 2011. 不同劑量復方中草藥免疫增強劑對草魚生長性能和免疫功能的影響. 上海海洋大學學報, 20(4): 534—540

李 霞, 馬馳原, 李雅娟等, 2011. 中草藥對牙鲆免疫力的影響. 東北農業大學學報, 42(3): 60—67

張照紅, 林 旋, 張偉妮等, 2011. 復方中草藥對奧尼羅非魚血液非特異性免疫功能的影響. 水產科學, 30(1): 1—5

陳孝煊, 吳志新, 殷居易等, 2003. 大黃、穿心蓮、板藍根和金銀花對異育銀鯽非特異性免疫機能的影響. 中國水產科學, 10(1): 36—40

孟小亮, 陳昌福, 吳志新等, 2009. 嗜水氣單胞菌 3種疫苗對斑點叉尾鮰免疫原性比較研究. 淡水漁業, 39(4): 49–53徐 歆, 2014. 紫錐菊提取物對小鼠免疫和抗沙門氏菌感染能力的影響及其機理研究. 杭州: 浙江大學博士學位論文

簡紀常, 吳灶和, 2002. 中草藥對建鯉非特異性免疫功能的影響. 大連水產學院學報, 17(2): 114—119

Amar E C, Kiron V, Satoh S et al, 2004. Enhancement of innate immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum)associated with dietary intake of carotenoids from natural products. Fish & Shellfish Immunolgy, 16(4): 527—537

Christybapita D, Divyagnaneswari M, Michael R D, 2007. Oral administration of Eclipta alba leaf aqueous extract enhances the non-specific immune responses and disease resistance of Oreochromis mossambicus. Fish & Shellfish Immunology,23(4): 840—852

Dolmatova L S, ELiseikina M G, Romashina V V, 2004. Antioxidant enzymatic activity of coelomocytes of the far east sea cucumber Eupentacta fraudatrix. Journal of Evolutionnary Biochemistry and Physiology, 40(2): 126—135

Miyazaki T, 1998. A simple method to evaluate respiratory burst activity of blood phagocytes from Japanese flounder. Fish Pathology, 33(3): 141—142

Ortu?o J, Esteban M A, Meseguer J, 2000. High dietary intake of α-tocopherol acetate enhances the non-specific immune response of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Fish &Shellfish Immunology, 10(4): 293—307

Rao Y V, Chakrabarti R, 2005. Stimulation of immunity in Indian major carp Catla catla with herbal feed ingredients. Fish &Shellfish Immunology, 18(4): 327—334