桑白皮有效成分分離純化的工藝研究Δ

董德剛，張秀英，劉小雪（1.大連醫科大學第二附屬醫院，遼寧大連 11607；.遼寧中醫藥大學研究生學院，沈陽 110847）

桑白皮為?？坡淙~灌木或小喬木植物桑Morus albaL.的干燥根皮，含有黃酮類、生物堿類、多糖類等多種物質，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[1]。藥理研究顯示，桑白皮總黃酮具有降低血糖血脂[2]、抗病毒[3]等作用；桑白皮提取物（桑黃酮含量＞30%）對實驗性糖尿病模型大鼠坐骨神經損傷有一定的改善作用[4]；桑白皮多糖對四氯化碳、對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷均有明顯的保護作用[5]；且桑白皮總黃酮、總多糖及總生物堿各部位均具有一定的降糖作用[6]。筆者擬根據桑白皮總黃酮、總多糖、總生物堿不同有效成分的性質，優選桑白皮有效部位的分離純化工藝，為有效提取桑白皮有效成分提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HH-S恒溫水浴鍋（金壇市億通電子有限公司）；KYC-1102恒溫搖床（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；UV-1750紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：130824，純度：≥98%）；葡萄糖對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：130407，純度：≥98%）；4-羥基哌啶（阿拉丁試劑有限公司，批號：41944，純度：98%）；D101大孔吸附樹脂、HPD400 大孔吸附樹脂、AB-8 大孔吸附樹脂、001×7 陽離子交換樹脂均購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；桑白皮飲片（遼寧中醫藥大學附屬第一醫院，批號：20140110）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總多糖、總黃酮、總生物堿的含量測定

2.1.1 總多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[7]。稱取葡萄糖對照品6.19 mg，置于50 ml 量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，超聲振蕩得0.123 8 mg/ml 的葡萄糖對照品貯備液。分別量取上述貯備液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml于具塞試管中，用蒸餾水定容至2.0 ml，再加入1.0 ml 6%苯酚溶液及5.0 ml 98%濃硫酸，蓋塞，靜置10 min，搖勻，再放置20 min，用分光光度計于490 nm波長處測定吸光度（A）。以質量濃度（c）為橫坐標、A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A＝7.828 3c－0.025 3（r＝0.999 1）。結果顯示，葡萄糖檢測質量濃度線性范圍為0.024 8～0.111 4 mg/ml。

2.1.2 總黃酮含量測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[8]。精密稱取蘆丁對照品5.690 1 mg 于50 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得蘆丁對照品溶液。準確吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml 蘆丁對照品溶液于10 ml 量瓶中，分別加乙醇至5 ml，然后加入0.05 g/ml亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入0.1 g/ml 硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 ml，再加無水乙醇至10 ml，搖勻，靜置15 min。用分光光度計于498 nm波長處測定A，以c為橫坐標、A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A＝6.545 6c+0.124 8（r＝0.998 4）。結果顯示，蘆丁檢測質量濃度線性范圍為0.011 4～0.091 1 mg/ml。

2.1.3 總生物堿含量測定 采用雷氏鹽比色法[9]。精密稱取4-羥基哌啶0.307 8 g，置于50 ml量瓶中，用0.05 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，得6.156 mg/ml 4-羥基哌啶對照品溶液。取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 ml 4-羥基哌啶對照品溶液于具塞試管中，加入0.05 mol/L HCl溶液至2 ml，再加入20 g/L的雷氏鹽溶液3 ml，搖勻，冰浴1 h，以離心半徑為15 cm（下同）、3 500 r/min離心10 min。取沉淀，用水洗滌至洗滌液無色，用70%丙酮溶液溶解沉淀，以3 500 r/min 離心5 min。用分光光度計于498 nm 波長處測定A，以c為橫坐標、A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.259 4c－0.137 8（r＝0.999 4）。結果顯示，4-羥基哌啶檢測質量濃度線性范圍為0.615 6～6.156 0 mg/ml。

2.2 桑白皮提取物的制備

根據文獻[10-12]，取干燥桑白皮粉碎，稱取100 g 加入8倍量80%（g/ml）乙醇浸泡，回流提取2次，每次2 h。收集提取液，蒸發濃縮，并加一定量蒸餾水稀釋提取液至質量濃度為0.1 g（生藥）/ml，此提取液作為總黃酮、總生物堿提取液。藥渣加8倍量蒸餾水回流提取2次，每次2 h，合并水提取液，減壓濃縮，此濃縮液作為總多糖提取液。

2.3 含量測定方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取葡萄糖對照品溶液1.0 ml、蘆丁對照品溶液2.0 ml、4-羥基哌啶對照品溶液1.0 ml，分別測定A，平行測定5 次。結果，葡萄糖、蘆丁、4-羥基哌啶A的RSD 分別為0.55%、0.37%、0.59%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 分別吸取桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，在30 min內，每隔5 min 測定1次A，一共測定6次。結果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的RSD分別為1.36%、1.11%、1.98%（n＝6），表明各供試品溶液在30 min 內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 分別吸取桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，各5份，分別測定其A。結果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的RSD 分別為1.29%、1.46%、1.81%（n＝5），表明本方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 分別吸取已知含量的桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，各5 份，分別加入一定量的相應對照品溶液，測定其A，計算平均回收率。結果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的平均加樣回收率分別為100.79%、101.45%、101.23%，RSD分別為1.21%、2.18%、1.48%（n＝5）。

2.4 總黃酮的分離純化

2.4.1 大孔吸附樹脂的篩選 將已處理好的D101、AB-8、HPD400 大孔吸附樹脂中游離水分抽干，稱取1 g，置于50 ml錐形瓶中，加入總黃酮提取液20 ml，25 ℃恒溫振蕩24 h，振蕩速度為130 r/min，使其充分吸附，抽濾，測定濾液A，計算總黃酮吸附率[吸附率＝（吸附量－初始量）/初始量×100%]。將樹脂抽濾至干，各加入95%乙醇20 ml，按前述振蕩條件振蕩24 h，使其充分解吸附，抽濾，測定濾液A，并計算總黃酮的靜態解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量×100%）。結果，D101、HPD400和AB-8 大孔對樹脂桑白皮黃酮的吸附率分別為78.32%、79.27%、76.49%，解吸率分別為70.12%、68.34%、62.79%。這表明D101 大孔吸附樹脂對桑白皮總黃酮的靜態吸附性能和靜態解吸附性能均較好，所以進一步研究其對桑白皮總黃酮的動態吸附。

2.4.2 上樣液量的篩選 量取D101大孔吸附樹脂10 ml，濕法裝柱，加入桑白皮總黃酮提取液，進行動態吸附的流速為1.0 ml/min，流出液每1 BV（柱體積倍數）收集1管并測定流出液中桑白皮總黃酮的A，繪制動態吸附曲線，見圖1。

圖1 不同上樣液量對桑白皮總黃酮吸光度的影響Fig 1 Effects of different loading amounts of fluid on the absorbancy of total flavonids from M.alba L.

由圖1 可知，D101 大孔吸附樹脂對桑白皮總黃酮動態吸附過程中，流出液的總黃酮濃度逐漸升高（A增大）；當上樣液體積為9 BV時，流出液總黃酮的濃度接近于桑白皮總黃酮原液濃度（流出液的A接近原液），達到了吸附平衡。因此，確定上樣液的最佳上樣液量為9 BV。

2.4.3 洗脫劑體積分數的篩選 準確吸取上樣液，平行4 份，以1.0 ml/min上柱，至吸附完全后，用水洗脫至無色，然后分別用30%、50%、70%、90%乙醇各40 ml洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液A，計算樹脂解吸量（解吸量＝洗脫液濃度×洗脫液體積）和總黃酮解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量×100%）。結果表明，D101 大孔吸附樹脂對桑白皮總黃酮解吸率隨乙醇體積分數的增大呈先增大后減小的變化趨勢，可能是由于乙醇體積分數增大，醇溶性的雜質增多，降低了解吸率。因此，確定以70%乙醇溶液進行洗脫，結果見表1。

表1 不同乙醇體積分數對桑白皮總黃酮的洗脫影響Tab 1 Effects of different volume fractions of alcohol on the elution of total flavonids from M.alba L.

2.4.4 洗脫劑用量的篩選 準確量取已處理好的D101 大孔吸附樹脂10 ml，準確吸取90 ml上樣液，以1.0 ml/min上柱，至吸附完全后，先用水洗脫，再用70%乙醇以1.0 ml/min 洗脫。流出液每1 BV收集1管，至流出液基本無黃酮時（測定流出液吸光度值很低，當7 BV時A＝0.127 8）停止。測定各流出液中桑白皮總黃酮的A，繪制桑白皮總黃酮的洗脫曲線，見圖2。

從圖2 可知，D101 大孔吸附樹脂在對桑白皮總黃酮的動態洗脫過程中，2 BV的70%乙醇對桑白皮總黃酮的洗脫效率最高，但5 BV左右的乙醇可以將其洗脫完全。因此，確定洗脫劑用量為5 BV。

圖2 不同洗脫劑用量對桑白皮總黃酮吸光度的影響Fig 2 Effects of different amounts of eluent on the absorbancy of total flavonids from M.alba L.

2.4.5 總黃酮的提取 綜上所述，確定了D101大孔吸附樹脂純化桑白皮總黃酮的最佳工藝為：上樣液質量濃度為0.1 g（生藥）/ml，最大上樣量9 BV，洗脫劑為70%的乙醇，洗脫劑用量為5 BV，減壓干燥乙醇洗脫液。按上述工藝條件操作后制得桑白皮總黃酮。

2.5 總多糖的分離純化

將桑白皮總多糖提取液分成3等份，分別加入95%乙醇，使其含醇體積分數至60%、70%、80%，靜置12 h，抽濾得總多糖沉淀。沉淀先后用無水乙醇、丙酮多次洗滌，干燥稱質量，計算總多糖得率；測定總多糖含量并計算總多糖純度。結果，3種乙醇體積分數下總多糖得率分別為1.7%、1.9%、2.5%，總多糖純度分別為40.22%、44.53%、47.15%。因此，確定沉淀多糖的最佳乙醇體積分數為80%。

2.6 總生物堿的分離純化

向總生物堿提取液中加入2 mol/L鹽酸，調節pH為2～4，抽濾，去除濾渣，將總生物堿濾液作為上柱樣品溶液。

2.6.1 上樣液量的篩選 量取預處理好的001×7 陽離子交換樹脂20 ml裝柱，將總生物堿濾液加入到離子交換柱中，流速2 ml/min，每1 BV收集1管，測定各流出液中桑白皮總生物堿A，繪制動態吸附曲線，見圖3。

圖3 不同上樣液量對桑白皮總生物堿吸光度的影響Fig 3 Effects of different loading amounts of fluid on the absorbancy of total alkaloids from M.alba L.

由圖3可知，流出液中桑白皮總生物堿的A至上樣液量為3 BV時趨于平緩，即上樣3 BV時已達到001×7陽離子交換樹脂對桑白皮總生物堿的最大吸附量。因此，確定最佳上樣液量為3 BV。

2.6.2 洗脫劑用量的篩選 準確量取桑白皮總生物堿提取液3 BV，通過已處理好的001×7陽離子交換樹脂柱，然后用去離子水洗至流出液為無色，再以0.5 mol/L 氨水洗脫，每1 BV 收集1管，測定各流出液中桑白皮總生物堿的A，繪制洗脫曲線，見圖4。

圖4 不同洗脫劑用量對桑白皮總生物堿吸光度的影響Fig 4 Effects of different amounts of eluent on the absorbancy of total alkaloids from M.alba L.

由圖4 可知，洗脫劑用量為3 BV 時流出液中桑白皮總生物堿濃度最高（A最大），至8 BV時洗脫完全。因此，確定將桑白皮總生物堿洗脫完全需要0.5 mol/L氨水8 BV。

2.6.3 總生物堿的提取 將收集的氨水洗脫液減壓濃縮，濃縮液中按1∶1 比例加入正丁醇，振搖提取5 次，合并正丁醇液。綜上結果，桑白皮總生物堿提取液以001×7陽離子交換樹脂為吸附劑，上樣3 BV后用0.5 mol/L氨水8 BV洗脫，將氨水洗脫液濃縮并用正丁醇萃取[濃縮液-正丁醇（1∶1，V/V）]，合并正丁醇液，減壓濃縮，干燥，得桑白皮總生物堿。

2.7 驗證試驗

根據“2.4”“2.5”“2.6”項下所述的桑白皮總黃酮、總多糖、總生物堿的純化工藝，各進行3 次驗證試驗。結果，桑白皮總黃酮干燥粉末的純度分別為35.67%、35.22%、36.14%，平均純度為35.68%，RSD為1.28%（n＝3）；桑白皮總多糖干燥粉末的純度分別為47.99%、46.51%、46.93%，平均純度為47.14%，RSD為1.61%（n＝3）；桑白皮總生物堿干燥粉末的純度分別為55.74%、56.45%、55.18%，平均純度為55.79%，RSD 為1.14%（n＝3）。結果表明上述純化工藝穩定、可靠。

3 討論

本研究通過D101大孔樹脂吸附、分離純化桑白皮總黃酮，通過水提醇沉的方法分離純化桑白皮總多糖，通過001×7 陽離子交換樹脂吸附與正丁醇萃取分離純化桑白皮總生物堿，其干燥后總多糖、總黃酮、總生物堿粉末平均純度分別為47.14%、35.68%、55.79%。筆者通過不同的分離純化方法，分別制得桑白皮3種不同有效成分，對于桑白皮的工業開發利用與藥理藥效的研究有一定意義。

水提醇沉是提取中藥中總多糖成分的一種經典工藝，具有方便、快捷、簡單的特點，本試驗方法可作為桑白皮總多糖的富集工藝。

針對總生物堿的性質選用強酸型陽離子交換樹脂，將酸化的總生物堿提取液通過樹脂，使總生物堿鹽的陽離子交換到樹脂上而與其他成分和雜質分離；再用氨水堿化得到游離態總生物堿，并經正丁醇萃取，萃取前后的純度分別為28%（未經萃取的生物堿溶液干燥后所得）、55%。因此，桑白皮總生物堿的提取純化工藝雖較復雜，但有效地增加了桑白皮總生物堿的純度。

桑白皮總黃酮的純度還有待提高，分析其原因如下：其一，可能是不同產地、不同采集時間及不同貯藏時間的桑白皮中總黃酮的含量差異較為明顯[13]。今后宜采用不同批次、不同產地的桑白皮進行對比試驗。其二，在考察總黃酮動態吸附曲線，上樣1 BV時便可檢測到總黃酮量，分析原因可能為打開閥時速度未控制理想或其他操作不當，也有可能試驗過程中對上樣速度、提取液濃度等相關重要參數選擇不合理。因此，擬在今后的研究中進一步優化此工藝，以提高桑白皮總黃酮的純度。

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