毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫方面的相互影響

李建梅，劉 梅，戴亞斌，陶建平

(1.中國農業科學院 家禽研究所，江蘇 揚州 225125；2.揚州大學 獸醫學院，江蘇 揚州 225009)

雞球蟲病是一種危害嚴重的雞腸道寄生蟲病，對世界范圍的養禽業造成了嚴重經濟損失[1]。目前，雞球蟲病病原主要有堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)7 種，其中柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的致病性最強，堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲具有中等強度的致病性[2-3]。在自然情況下，雞球蟲病往往呈多種球蟲混合感染[4]。傳統治療雞球蟲病的方法主要依靠磺胺類化學藥物，但隨著人們對肉蛋中藥物殘留問題的日益關注以及雞球蟲耐藥蟲株的不斷出現，不少抗球蟲藥在國際上已開始列為禁用藥，使得藥物防治面臨困境，這就迫使人們將目光轉向免疫預防等替代途徑來防控雞球蟲病[5]。目前，臨床上使用的雞球蟲病疫苗多數是由數種雞球蟲組成的活蟲苗，有些種類在雞腸道內的寄生部位相同，如毒害艾美耳球蟲在裂殖生殖階段與巨型艾美耳球蟲寄生部位相同，而在配子生殖階段與柔嫩艾美耳球蟲的寄生部位又相同，這種相同的寄生部位在免疫上是否會相互影響。為此，本研究探索了毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫上的相互影響，為今后雞球蟲病的免疫預防奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 蟲 株 毒害艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲南通株均為田間分離株，由揚州大學寄生蟲教研室分離保存，實驗前均經雞體傳代復壯。

1.2 實驗動物及主要試劑 蘇禽黃羽肉雞購自中國農業科學院家禽研究所育種中心，出殼后運回實驗室，飼養在無球蟲的環境中，飼喂不含任何抗球蟲藥的全價飼料。實驗開始前，采用常規方法鏡檢有無球蟲卵囊，確認無球蟲卵囊污染后，方可用于實驗。辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG(IgG-HRP)購自HPL 公司。

1.3 實驗設計 挑選體況相近的5 日齡黃羽肉雞132 只，分成11 組，每組12 只。免疫和攻蟲途徑均采用嗉囊接種途徑，實驗設計和免疫程序見表1，其中未免疫攻蟲組免疫時以及陰性對照組免疫和攻蟲時每次接種1 mL PBS。二免前和攻蟲前每組隨機取5 只雞，無菌心臟采血1 mL，分離血清，用于檢測其抗球蟲的抗體水平。

表1 實驗分組與免疫程序Table 1 Groups and immunization schedules

1.4 臨床觀察 攻蟲后觀察雞的精神狀態、飲欲食欲、糞便與發病情況。攻蟲后第8 d 結束實驗，以平均增重、死亡率、平均腸道病變記分等作為實驗指標。

1.5 卵囊計數 參照文獻[6]的方法，即攻蟲后第6 d 起每12 h 收集各組雞的全部糞便樣品，攪拌后稀釋至1 000 mL，吸取10 個1 mL 置于小燒杯內，加1 mL 次氯酸鈉溶液作用2 h 后，加飽和食鹽水定容至60 mL，先用60 目銅篩過濾，濾液用麥克馬斯特法進行卵囊計數，計算出每只雞的總排卵囊量。

1.6 免疫保護效果評價指標(1)死亡率(%)：死亡雞數/開始雞數×100 %；(2)相對增重率(%)：免疫攻蟲組或未免疫攻蟲組雞的平均增重/未免疫未攻蟲組雞的平均增重×100 %。其中：①平均增重1=攻蟲時重-首次免疫時體重；②相對增重率1=(實驗組增重/未免疫未攻蟲組增重)×100 %；③平均增重2=宰殺時重-攻蟲時重；④相對增重率2=(實驗組增重/未免疫未攻蟲組增重)×100 %；(3)相對卵囊產量：相對卵囊產量=(實驗組排出卵囊數/未免疫攻蟲組排出卵囊數)×100 %；(4)卵囊減少率：卵囊減少率=(未免疫攻蟲組排卵囊數-免疫攻蟲組排卵囊數)/未免疫攻蟲組排卵囊數；(5)病變記分：平均腸道病變記分參照Johnson 和Reid[7]的標準。

1.7 血清抗體水平檢測 采用間接ELISA 法進行血清抗體水平檢測，即采用JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎儀裂解各球蟲孢子化卵囊，4 ℃12 000 r/min 離心15 min 取上清，獲取純化蛋白，以其為抗原包被96 孔板，加入稀釋后的待檢血清100 μL/孔，37 ℃溫育2 h，以羊抗雞IgG-HRP(1∶1 000)為二抗，OPD底物顯色，利用酶標儀測定OD490nm值。

1.8 數據處理與分析 利用SPSS 軟件對實驗數據進行一維方差描述性統計分析，并用Duncan 氏新復極差法對組間平均值進行多重比較(p<0.05)。

2 結果

2.1 臨床觀察結果

2.1.1 非免疫攻蟲組 各非免疫攻蟲組實驗雞在攻蟲后第4 d 起分別出現臨床癥狀。非免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組最先表現出臨床癥狀，排鮮紅色血便，第5 d 血便達到高峰，第6 d 開始出現死亡，剖檢死亡雞其盲腸外觀腫大呈暗紅色、腸腔內充滿紅色血液和脫落的黏膜碎片。

非免疫攻毒害艾美耳球蟲組第5 d 開始排醬油色血便，有的血便周圍有乳白色油狀物，第6 d 開始出現死亡，剖檢死亡雞，發現整個小腸段腫大，尤其是卵黃蒂前后，漿膜面可見針尖狀出血點和小白斑，腸壁菲薄呈紅色或粉紅色，腸腔內混有較多血凝塊和脫落的腸黏膜。

非免疫攻巨型艾美耳球蟲組也于第5 d 開始出現癥狀，排出典型的棉線樣稀糞，第6 d 開始出現死亡，剖檢死亡雞小腸段出現腫脹、腸內容物稀薄呈粘稠狀米黃色、黏膜水腫增厚并伴有少量出血點。

2.1.2 免疫攻蟲組 毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組，攻毒害艾美耳球蟲后第6 d 開始出現血便，并有2 只雞死亡，而攻巨型艾美耳球蟲組僅出現糞便變??；毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組，分別攻毒害艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲后均有血便出現，但前者的血便數明顯多于后者，并且有1 只雞攻毒害艾美耳球蟲后死亡；毒害艾美耳球蟲單獨免疫組攻蟲后出現的血便數較柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組攻蟲后的要多，并且前者有1 只雞在攻毒害艾美耳球蟲后第7 d 死亡；巨型艾美耳球蟲單獨免疫組攻蟲后糞便只是略顯稀薄，不排血便。

2.2 死亡率和平均腸道病變記分 攻毒害艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨免疫組均出現死亡，但死亡率明顯低于非免疫攻毒害艾美耳球蟲組。同時，毒害艾美耳球蟲單獨免疫組死亡率雖低于混合免疫組，但差異不顯著(p>0.05)。非免疫攻毒害艾美耳球蟲組病變記分顯著高于免疫攻蟲組(p<0.05)，其中毒害艾美耳球蟲單獨免疫組的病變記分高于混合免疫組，但無顯著差異(p>0.05)(表2)，表明混合免疫組對毒害艾美耳球蟲的免疫保護效果優于毒害艾美耳球蟲單獨免疫組。

攻巨型艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組及巨型艾美耳球蟲單獨免疫組均未出現死亡。免疫攻蟲組病變記分顯著小于非免疫攻巨型艾美耳球蟲組(p<0.05)，其中巨型艾美耳球蟲單獨免疫組病變記分為零(表2)，表明巨型艾美耳球蟲單獨免疫組對巨型艾美耳球蟲的免疫保護效果優于混合免疫組。

攻柔嫩艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組死亡率均為零。免疫攻蟲組病變記分顯著小于非免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組(p<0.05)，其中柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組病變記分略高于混合免疫組，但無顯著差異(p>0.05)(表2)，表明柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護效果與混合免疫組相比差異不大。

2.3 增重情況 免疫后各實驗組平均增重與未免疫未攻蟲組相比無明顯差異(p<0.05)，各免疫組相對增重率均在90 %以上(表3)。

攻毒害艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組平均增重與毒害艾美耳球蟲單獨免疫組、未免疫攻毒害艾美耳球蟲組相比差異顯著(p<0.05)，其中毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，而毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨免疫組與未免疫未攻蟲組相比差異顯著(p<0.05)。毒害艾美耳球蟲單獨免疫組相對增重率明顯低于混合免疫組，但仍高于未免疫攻毒害艾美耳球蟲組(表3)。表明毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組對毒害艾美耳球蟲的免疫保護效果最好，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組次之，毒害艾美耳球蟲單獨免疫組最差。

攻巨型艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、巨型艾美耳球蟲單獨免疫組平均增重顯著高于未免疫攻巨型艾美耳球蟲組(p<0.05)，而與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，其相對增重率均在95.00 %以上(表3)。表明混合免疫組對巨型艾美耳球蟲的免疫保護效果略低于巨型艾美耳球蟲單獨免疫組。

攻柔嫩艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組、柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組平均增重顯著高于未免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組(p<0.05)，而與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，其相對增重率均在79.00 %左右(表3)。表明混合免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護效果相當。

表2 各實驗組雞病死率、平均腸道病變記分及卵囊產量Table 2 The mortality,mean intestinal lesion score and oocyst production of each group

表3 各實驗組雞增重情況Table 3 Weight gain of each group post-challenge

2.4 卵囊產量、相對卵囊產量與卵囊減少率 除未免疫未攻蟲組外，各實驗組雞均有不同數量的卵囊排出，其中以未免疫攻巨型艾美耳球蟲組、未免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組排出的卵囊數量最多，而未免疫攻毒害艾美耳球蟲組雞因發病而在未形成卵囊時就已經大量死亡，存活的雞也由于該球蟲對其腸道造成的嚴重損傷而形成卵囊的數量較少，因而卵囊產量與其它組相比明顯要少，其卵囊產量甚至比毒害艾美耳球蟲單獨免疫組的要低(表2)。

攻蟲后，除毒害艾美耳球蟲單獨免疫組外，各免疫組卵囊產量、相對卵囊產量均低于各未免疫攻蟲組。另外，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨免疫組攻毒害艾美耳球蟲后卵囊減少率均較低，毒害艾美耳球蟲單獨免疫組為負值；毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組和巨型艾美耳球蟲單獨免疫組攻巨型艾美耳球蟲后卵囊減少率分別為93 %和100 %；毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組攻柔嫩艾美耳球蟲后卵囊減少率分別為89.61 %和82.79 %(表2)。表明混合免疫組對毒害艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護效果優于毒害艾美耳球蟲單獨免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組，而對巨型艾美耳球蟲的免疫保護效果低于巨型艾美耳球蟲單獨免疫組。

2.5 血清抗體水平 采用間接ELISA 法分別測定各實驗組雞一免后和二免后的抗體水平，分析毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫上的相互影響。

2.5.1 毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲間的相互影響 一免后混合免疫組與巨型艾美耳球蟲單獨免疫組間的抗巨型艾美耳球蟲抗體水平無顯著差異(p>0.05)；二免后巨型艾美耳球蟲單獨免疫組抗體水平顯著高于混合免疫組(p<0.05)(表4)。二免后混合免疫組抗體水平與一免時相比均有所下降，而巨型艾美耳球蟲單獨免疫組抗體水平則比一免時要高。表明毒害艾美耳球蟲干擾了巨型艾美耳球蟲抗體的生成。

表4 毒害艾美耳球蟲對巨型艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 4 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

一免后混合免疫組與毒害艾美耳球蟲單獨免疫組間抗毒害艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)；二免后混合免疫組抗體水平顯著高于毒害艾美耳球蟲單獨免疫組(p<0.05)(表5)。二免后各免疫組抗體水平較一免時均有所下降，但混合免疫組抗體水平在一免和二免后均高于毒害艾美耳球蟲單獨免疫組。表明巨型艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體的生成存在免疫協同效應。

2.5.2 毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲間的相互影響 一免和二免后混合免疫組與柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫組間抗柔嫩艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)(表6)。二免后各免疫組的抗體水平均增加。表明毒害艾美耳球蟲對柔嫩艾美耳球蟲抗體的生成無干擾。

一免后混合免疫組與毒害艾美耳球蟲單獨免疫組間抗毒害艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)。二免后混合免疫組抗體水平顯著高于毒害艾美耳球蟲單獨免疫組(p<0.05)(表7)。二免后毒害艾美耳球蟲單獨免疫組抗體水平與一免時相比迅速下降，而混合免疫組一免和二免后的抗體水平變化不大。表明柔嫩艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體的生成存在免疫協同效應。

表5 巨型艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 5 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

表6 毒害艾美耳球蟲對柔嫩艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 6 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

表7 柔嫩艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 7 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

3 討論

本研究結果顯示毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫對毒害艾美耳球蟲的免疫保護效果比毒害艾美耳球蟲單獨免疫好，而對巨型艾美耳球蟲的免疫保護力則略低于巨型艾美耳球蟲單獨免疫，但仍具有免疫保護性；毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫對毒害艾美耳球蟲的免疫保護效果優于毒害艾美耳球蟲單獨免疫，而對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護力與柔嫩艾美耳球蟲單獨免疫相比差異不大。原因可能是毒害艾美耳球蟲致病性很強，免疫原性相對較弱，并且裂殖生殖階段與巨型艾美耳球蟲寄生部位相同，二者之間存在一定的競爭關系，從而對同源攻擊缺乏抵抗力，而柔嫩艾美耳球蟲則是在有性生殖階段與毒害艾美耳球蟲寄生部位相同。

臨床癥狀、平均腸道病變記分、死亡率、增重、卵囊減少率等結果表明巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲均具有良好的免疫原性，而毒害艾美耳球蟲的免疫原性較差。這與Talebi 等認為的巨型艾美耳球蟲是雞體內致病性球蟲中免疫原性最強的球蟲之一的結論相符[8]，同時也支持陶建平等認為的巨型艾美耳球蟲南通株的免疫原性最廣譜，可用作疫苗候選株的結論[6]。Chapman 等認為毒害艾美耳球蟲的免疫原性在雞的7 種球蟲中最弱[9]，本研究也證實了這一結論。這一研究結果表明在雞球蟲的免疫研究中，不同種球蟲的抗原存在差異，同種不同株間的抗原也存在差異，同一個體的不同發育階段抗原也不盡相同[10]。

根據ELISA 檢測結果顯示毒害艾美耳球蟲單獨免疫后抗體水平上升較快，但持續時間短，很快下降。這與卞國志等認為的雛雞口服免疫接種一定劑量毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊后可迅速誘導雞體產生特異性免疫力，但免疫保護力在籠養條件下持續時間較短的結論一致[11]。

迄今為止，很多國內外學者認為由T 淋巴細胞、NK 細胞、巨噬細胞介導的細胞免疫在雞球蟲病的保護性免疫應答中起重要做用[12]，但在球蟲感染期間特異性循環抗體和sIgA 的出現，以及從雞高免血清中分離出的丙球蛋白可與相應球蟲子孢子、成熟裂殖體及配子體發生特異免疫熒光反應，提示體液免疫在抗球蟲免疫研究中也發揮著十分重要的作用[13]。同時雞球蟲免疫血清還可作為一種有用的診斷工具來確定艾美耳球蟲在雞群中或單個雞中的存在情況，或是用于對雞球蟲疫苗免疫程序的監測[14]。因此，本研究利用ELISA 法監測各個艾美耳球蟲抗體與相應抗原之間的免疫應答效應，但發現免疫雞卵囊排出量與抗體水平之間缺乏聯系，這一研究結果與Talebi 等的研究結果相一致[8]。

[1]A llen P C,Fetterer R H.Recent advances in biology and immunobiology of Eimeria species and in diagnosis and control of infectionwith these coccidian parasites of poultry[J].Clin Microbiol Rev,2002,15(1):58-65.

[2]Thebo P,Lunden A,Uggla A,Hooshmand-Rad P.Identification of seven Eimeria species in Swedish domestic fowl[J].Avian Pathol,1998,27(6):613-617.

[3]Rose M E.Coccidiosis:immunity and the prospects for prophylactic immunization[J].Vet Rec,1976,98(24):481-484.

[4]陶建平，孫秀紅，孫壽永，等.動物醫院門診病雞球蟲感染情況及其種類調查[J].中國獸醫寄生蟲病，2003，11(2)：40-42.

[5]Shirley M W,Smith A L,Tomley F M.The biology of Avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination[J].Adv Parasitol,2005,60:285-330.

[6]陶建平，沈永林，李文超，等.11 株巨型艾美耳球蟲的免疫原性分析[J].南京農業大學學報，2005，28(4)：104-108.

[7]Johnson J,Reid W M.Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques in battery and floorpenexperioments with chickens[J].Exp Parastiol,1970,28(1):30-36.

[8]Talebi A，Mulcahy G，李玉煥.巨型艾美耳球蟲感染雞免疫反應與卵囊排出量的關系[J].中國獸醫寄生蟲病，1997，5(3)：56-58.

[9]Chapman H D,Cherry T E,Danforth H D,et al.Sustainable coccidiosis control in poultry production:the role of live vaccines[J].Int J Parasitol,2002,32(5):617-629.

[10]Norton C C,Hein H E.Eimeria maxium:A comparison of two laboratory strains with a fresh isolate[J].Parasitology,1976,72(3):345-354.

[11]卞國志，蔡建平，謝明權，等.不同劑量和免疫次數對雞毒害艾美球蟲免疫保護力度影響[J].中國獸醫學報，2006，26(1)：39-42.

[12]Dalloul R A,Lillehoj H S.Recent advances in immunomodulatio and vaccination strategies against coccidiosis[J].Avian Dis,2005,49(1):1-8.

[13]劉晶，胡京友，鄭世民.體液免疫在雞球蟲感染中的作用[J].動物醫學進展，2004，25(6)：21-23.

[14]Constantinoiu C C,Molloy J B,Jorgensen W K,et al.Development and validation of an ELISA for detecting antibodies to Eimeria tenella in chickens[J].Vet Parasitol,2007,150(4):306-313.