中藥異位寧對子宮內膜異位癥大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3信號傳導通路的影響

孫可豐，李娜，時思毛，趙顏，楊德芳，馮曉玲

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EM，簡稱內異癥)多發于育齡期女性，臨床表現以痛經、下腹痛和性交痛為主，其發病率逐年上升，近幾年可達10%～15%，占普通婦科手術的30%以上。近年來，內異癥引起的不孕癥也成為了研究熱點之一，嚴重地影響了婦女的生活質量及身心健康。無生育要求的內異癥患者以減滅和消除病灶，減輕和消除疼痛，減少和避免復發為主要治療原則［1-2］。鑒于內異癥的手術治療效果不甚理想，術后又易于復發，有生育要求患者應謹慎選擇手術治療，因此，藥物治療仍占重要地位［3］。本研究通過探討中藥復方異位寧對Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白表達的影響來闡述異位寧治療子宮內膜異位癥的作用機制，為其推廣應用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar雌性大鼠，8～12周齡，未孕，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，微生物控制等級一級。

1.2 實驗藥物

中藥復方異位寧:赤芍15g，金銀花20g，延胡索20g，莪術10g，蜈蚣1條，牡蠣15g，薏苡仁15g，柴胡20g，由黑龍江中醫藥大學門診藥局統一煎制提供。達那唑:200mg/粒，江蘇聯環藥業股份有限公司，批號20010101。

1.3 實驗試劑

大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白檢測試劑盒及免疫組化染色試劑盒，均由武漢博士德生物工程公司提供。

2 實驗方法

2.1 EM 大鼠模型制備方法

乙烯雌酚0.2mg/只皮下注射促情，麻醉后無菌條件下開腹，分離并結扎右側子宮，取中段2cm，縱形剪開，剝離宮內膜，剪成等大3塊，分別縫合于子宮交叉處、左側卵巢、左側腹膜壁層，術畢，關腹。每只大鼠術后每日腹腔注射慶大霉素0.1ml，共3天。

2.2 分組及給藥

模型制備后正常飼養1個月，隨機分為五組，異位寧高劑量組(n=10)每日5.4g/100g異位寧灌胃;異位寧低劑量組(n=10)每日1.8g/100g異位寧灌胃;西藥組(n=11)，每日3.6g/100g達那唑混懸液灌胃;正常對照組(n=11)不予任何處理;模型組(n=9)每日以等量生理鹽水灌胃;五組大鼠均灌胃1個月。

2.3 切片及染色、Western-Blot

灌胃結束后，大鼠眶后取血，斷髓處死，解剖獲取大鼠正常對照組在位子宮內膜，及其余各組大鼠子宮交叉處的異位子宮內膜，常規石蠟包埋，切片，采用免疫組化法，常規處理后顯微鏡觀察。Western-Blot法:提取獲得組織之蛋白，按照蛋白印跡實驗步驟嚴格操作。

3 實驗結果

3.1 實驗造模結果

造模術后飼養1個月，隨機抽取8只大鼠二次開腹?？梢?移植宮內膜體積增大，部分增大物內含液性物體;或由結締組織包裹，腹壁、大網、腸管廣泛粘連，說明動物模型制備成功。

3.2 HE染色光鏡下觀察結果

由圖1可見，異位寧高劑量組:在位內膜組織形態無顯著變化，腺體結構完整，腺上皮排列緊密、整齊，異位內膜組織腺體數目減少、腺腔萎縮，血管數目減少，腺腔內無炎性滲出物蓄積，間質細胞細小而稀疏。

異位寧低劑量組:在位內膜組織腺腔形態無明顯改變，異位內膜腺體數目減少，腺腔變小，腺上皮萎縮。間質細胞數量、體積均減小。

空白組:正常在位子宮內膜厚度如常，腺體數量如常，分布均勻，間質細胞大小如常、分布均勻、腺體完整，腺上皮細胞排列整齊，高柱狀，可見核下空泡和頂漿分泌。

模型組:異位內膜呈鋸齒封閉式結構或子宮腔狀，腺體數目較正常組明顯減少，間質細胞較細長，內含豐富血管，腺上皮細胞增生，有少數腺體擴散，腔內蓄有炎性滲出物，周圍纖維增生包裹。

3.3 各組大鼠內膜Bcl-2、Fas、Caspase-3表達

3.3.1 免疫組化判斷標準

根據染色強度及陽性細胞比例行半定量判定。陽性染色:細胞漿內見棕黃色顆粒染色，即判定為陽性，染色強度標準:0分為陰性;強于陰性但染色弱者1分;中等強度染色2分;強染色3分。染色陽性細胞比例評定標準:陰性0分，陽性細胞數＜5%;弱陽性1分，陽性細胞數5%～25%;陽性2分，陽性細胞數為26%～50%;強陽性3分，陽性細胞數為51%～75%;非常強陽性4分，陽性細胞數75%以上。其陽性積分為二者評分相加。

實驗結果顯示:模型組Bcl-2陽性表達較正常組增高，有顯著性差異(P＜0.01);高、低劑量組與模型組相比(P＜0.01)，說明異位寧能夠降低Bcl-2表達;西藥組(達那唑組)與模型組相比(P＜0.01)，說明異位寧高、低劑量組可降低Bcl-2的表達，療效較達那唑組顯著，有極顯著性差異(P＜0.01)，說明中藥異位寧在降低Bcl-2陽性表達方面較西藥達那唑療效顯著。

模型組Fas、Caspase-3陽性表達增高，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01);高、低劑量組與模型組相比(P＜0.01)，異位寧可升高Fas、Caspase-3陽性率的表達。西藥組(達那唑組)與模型組相比(P＜0.01)，亦可能激活Fas、Caspase-3的表達，結果見表1。

圖1 HE染色光鏡下觀察結果

表1 各組大鼠內膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3表達()

表1 各組大鼠內膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3表達()

注:與正常組相比，#P＜0.01;與模型組相比，*P＜0.01;與西藥組相比，▲P＜0.01。

組別n Bcl-2 Fas Caspase-3正常組11 1.54±0.76 1.36±0.84 1.44±0.84模型組 9 5.10±1.46#▲ 2.26±1.12＊▲ 2.14±1.28*▲異位寧高劑量組10 2.06±1.32＊▲ 5.07±1.26#▲ 5.12±1.38#▲異位寧低劑量組10 2.43±1.34＊▲ 3.01±1.23＊▲ 3.10±1.15＊▲西藥組 11 3.11±1.13* 2.23±1.44* 2.38±1.42*

3.3.2 Western-Blot結果

各組大鼠內膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白印記表達結果顯示(見圖2)，異位寧高劑量組及低劑量組兩組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達量均顯著降低(P＜0.01)，而Fas、Caspase-3蛋白表達量則增高(P＜0.01)。實驗結果表明，異位寧能夠降低Bcl-2表達，增加Fas、Caspase-3表達，促進異位內膜細胞的凋亡能力，限制于宮腔外種殖的異位內膜細胞的存活能力，使病灶萎縮，最終達到治療目的。同時提示藥物濃度對Bcl-2、Fas、Caspase-3的表達可能有影響，但有待進一步研究驗證。

圖2 Western-Blot結果

4 討論

細胞凋亡是通過凋亡信號轉導途徑，而啟動細胞內死亡機制，最后導致細胞的程序性變性和壞死的過程。其基本過程是誘導因子刺激細胞表面，信號傳入，而激活內源性脫氧核糖核酸，從而導致細胞的自然死亡。此過程參與有機體的發育生殖、老化、免疫等生理過程，增殖性疾病、腫瘤、自身免疫疾病等多種疾病的發生發展均與此關系密切。

4.1 Bcl-2在EM中的作用

細胞凋亡由許多癌基因和抑癌基因調控，Bcl-2基因家族在其中占據重要地位。Bcl-2基因家族是一組具有同源結構域(BH)基因，已發現有超過20的Bcl-2家族成員，由于BH成分的差異，Bcl-2家族成員的生物學功能不同，Bcl-2家族分為以下兩組:第一、抗凋亡成員，如Bcl-2，Bcl XL，Bcl-w等;第二、如Bax，Bak，Bid等則屬于促凋亡成員。研究表明，體內Bcl-2家族發揮作用的形式為二聚體?？沟蛲龀蓡T主要分布于線粒體外膜，并與促凋亡成員BH3結構域相互作用，在細胞凋亡中發揮作用，抑制細胞凋亡。

凋亡抑制基因Bcl-2相關蛋白主要存在于核膜和內質網及線粒體膜上。許多正常組織及腫瘤組織中均有Bcl-2的表達，但除外淋巴組織，該基因若過度表達，可以防止或延遲正常細胞分化，延長細胞的壽命，增加細胞的數量，而引起腫瘤或增殖性疾病。在月經周期中，細胞凋亡及其調控基因在子宮內膜周期性變化中起重要作用。Bcl-2在正常子宮內膜中的增殖期表達增加，Bas亦上升，Bcl-2/Bas比值維持相對平衡，減少在正常子宮內膜腺上皮細胞通過線粒體途徑引起的細胞凋亡，從而使內膜正常增殖及修復;而分泌期Bcl-2表達則急速下調，BAS轉移到線粒體與Bcl-2結合，Caspase激活，而使Bcl-2持續高表達，而得以逃避凋亡，利于子宮內膜的修復。有報道稱，EM中Bcl-2在異位內膜中強表達，且無明顯周期性變化，增殖期、分泌期均強表達，與正常子宮內膜及非異位內膜中存在顯著差異。

4.2 Fas在EM中的作用

Fas在介導細胞凋亡中是一個重要膜蛋白分子。研究表明，Fas介導的子宮內膜細胞凋亡，可能是子宮內膜病變發生的關鍵。本研究發現，Fas主要于子宮內膜腺細胞和/或胞漿中表達。大量研究發現，Fas表達在子宮內膜中減少，則免疫細胞(如NK細胞)無法有效去除Fas陽性的免疫細胞，反誘導細胞凋亡產生主動免疫耐受過程，導致逆流到盆腔的子宮內膜細胞逃脫免疫監視，活性高而利于異位植入成活，促進子宮內膜異位癥的發生。因此，提示Fas/FasL誘導的細胞凋亡途徑是其共同發病機制。

4.3 Caspase-3在EM中的作用

細胞凋亡是各種死亡信號激活后，細胞死亡的主動過程。Caspase-3家族在誘導細胞凋亡的分子機制中作用關鍵，為多條凋亡途徑的關鍵點，是細胞凋亡的最終途徑。大量的研究已經證實，Caspase-3是Caspase家族中與凋亡最密切的基因，因其位于兩條細胞凋亡信號通路的中心，直接參與細胞凋亡過程，導致細胞凋亡，因此，Caspase-3能夠反應細胞凋亡的程度。

以上我們可以看出，Bcl-2的高表達及Fas、Caspase-3的低表達可下調異位內膜的凋亡率，使細胞周期延長。而異位內膜細胞正是因為三者蛋白表達的改變，使其凋亡率遠低于正常子宮內膜及EM的在位內膜，并延長了異位內膜細胞生長周期，故異位病灶可以不斷發展。

根據我們的實驗結果顯示，異位寧高劑量組及低劑量組可顯著降低Bcl-2陽性表達率，升高Fas、Caspase-3陽性表達率，說明異位寧能夠降低Bcl-2表達，增加Fas、Caspase-3表達，增強宮腔外種植的異位內膜細胞的凋亡能力，同時減弱異位內膜細胞的存活能力，使病灶萎縮，最終達到治療目的?？梢灶A見，中藥異位寧作為作為Bcl-2、Fas、Caspase-3選擇性抑制劑將會更廣泛地應用到臨床，為中藥異位寧治療子宮內膜異位癥的機理研究提供了新的思路。

［1］郎景和.子宮內膜異位癥的研究與設想［J］.中華婦產科雜志，2003，38(8):478-480.

［2］馬小娜，閆軍堂，任國輝，等.子宮內膜異位癥中醫病因病機的認識探討［J］.中醫藥學報，2012，40(3):63-66.

［3］周應芳.子宮內膜異位癥的臨床診斷和治療［J］.中華婦產科雜志，2005，40(1):67-70.