重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的質量研究

陸珉，黃青山，張繼恩

(1．復旦大學生命科學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433；2．昆山博青生物科技有限公司，江蘇昆山215316)

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重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的質量研究

陸珉1,2，黃青山1,2，張繼恩2*

(1．復旦大學生命科學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433；2．昆山博青生物科技有限公司，江蘇昆山215316)

對重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片進行質量研究?？疾炫蒡v片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時限、微生物限度、發泡量、重量差異以及含量測定(主要針對含量測定進行方法學驗證)，確定泡騰片質量標準；同時考察泡騰片的穩定性。結果表明，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時限、微生物限度、發泡量、重量差異結果符合要求，含量測定為標示量的80%～150%。穩定性實驗表明在干燥、陰涼、密封條件下，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片至少能保質24個月。由此確定泡騰片質量符合擬定的企業質量標準。

重組溶葡萄球菌酶；陰道泡騰片；質量研究

母豬陰道炎是母豬繁殖障礙病中的主要疾病之一，引發豬陰道炎的病原細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌等。調查顯示，母豬陰道炎發病率高，且治愈率低。目前尚缺少相應的生物新型藥物治療母豬陰道炎[1-3]。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片是一種用于治療哺乳動物陰道炎的陰道泡騰片劑。該制劑通過給藥進入哺乳動物陰道后，能夠在體液的作用下泡騰崩解，使藥物混合于泡沫中快速釋放，藥物與陰道黏膜的接觸面積更大，使藥物能滲入黏膜褶皺深部，延長藥物與黏膜作用時間，提高局部組織藥物濃度，進而增強治療效果，有效殺滅由葡萄球菌、鏈球菌等引起的細菌性陰道炎。本研究考察重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時限、微生物限度、發泡量、重量差異以及含量測定，同時考察陰道泡騰片的穩定性，以期建立重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的質量標準。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 W-CJ-2D型雙人超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)；HTY-300型微生物限度檢測儀(杭州泰林生物技術設備有限公司)；UV757型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；高速冷凍離心機(艾本德(上海)國際貿易有限公司)；融變時限儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海方瑞儀器有限公司)。

1.2 試劑 營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉培養基(中國醫藥集團化學試劑有限公司)；十六烷基三甲基溴化銨培養基、哥倫比亞瓊脂培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(上海盛思生化科技有限公司)，色源底物KNR-PG(偶聯活性艷藍染料KNR的金黃色葡萄球菌細胞壁肽聚糖)；溶葡萄球菌酶工作參考品(上海高科聯合生物技術研發有限公司，290 U/支，批號：20130403)；甘氨酸(上?；菖d生化試劑有限公司)；氫氧化鈉(上海山浦化工有限公司)；Tris，HCl(上海藍季科技發展有限公司)。

重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片3批，批號：20110301、20110302、20110401、20141101、20141102、20141103，昆山博青生物科技有限公司生產。

2 方法

2.1 樣品檢測 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片，按2010年版《中華人民共和國獸藥典》[4]及2010年版《中華人民共和國藥典》[5]要求，對外觀性狀、鑒別、酸堿度、融變時限、微生物限度、發泡量、重量差異進行測定。

2.2 含量測定 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片1片，精密加0.05 mol/L Tris-鹽酸緩沖液20 mL，使成每1 mL中約含10單位的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液，以重組溶葡萄球菌酶標準品作為校準，照農業部公告的方法測定[6]。

重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片由于其配方、作用原理及使用方法與原有的重組溶葡萄球菌酶粉不同，在檢測時需提前進行泡騰溶解，在泡騰時會產生一定體積的泡沫，因此，在選擇色源底物比色法作為重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的酶含量檢測方法時，對該方法重新進行了方法學的驗證。主要從重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的特點出發，考察現有檢測方法在測定重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片時的線性范圍、準確性、精密性、專屬性及耐用性等方面是否符合相關要求。

2.2.1 線性與范圍 按表1所示，取一定量酶活測定供試品溶液用于測定，按管號加入對應量的標準品品溶液，共測定10個稀釋度，每個稀釋度重復測定3份。

表1 線性與范圍測定

2.2.2 準確性 用重組溶葡萄球菌酶標準品制備標準曲線，取泡騰片樣品泡騰于20 mL體積純化水中，0.45 μm微孔濾膜過濾，取泡騰液50 μL加樣，進行酶含量測定，同時取一粒泡騰片所需的壓制前混合粉，溶解泡騰于同樣體積中，取泡騰液進行含量測定，另取以制備該批泡騰片所用的同批次同等量的酶粉作為對照，檢測陰道泡騰片劑樣品中的重組溶葡萄球菌酶在不同時期酶含量的回收率。以上試驗重復3次。

以標準品活性(U/mL)與相對應的OD595值進行線性回歸，求得回歸曲線方程及曲線參數，根據樣品測得的OD595值與回歸方程求得樣品的酶活性。以溶葡萄球菌酶酶粉測定結果為100%標示量，比較其他兩組樣品對標示量的回收率及比較3組測定值的均值、標準差及變異系數。

2.2.3 試驗內精密度 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測定供試品溶液，加樣體積分別為30、50、70 μL，每個體積加平行10管，依法測定。

2.2.4 試驗間精密度 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測定供試品溶液，加樣體積分別為30、50、70 μL，每個體積加平行3管，依法測定。共進行3次，由不同檢測人員分別測定。

2.2.5 專屬性 取重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片酶活測定供試品溶液，進行酶含量測定，同時不含溶葡萄球菌酶的空白陰道泡騰片作為對照品，同法進行泡騰及測定。實驗重復3次。

2.3 穩定性試驗 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的穩定性試驗包括加速試驗、長期留樣試驗兩部分。根據《中華人民共和國獸藥典》附錄246“獸藥穩定性試驗指導原則”要求，對重組溶葡萄球菌酶泡騰片進行4500lx±500lx照度條件下的光照影響因素試驗；(60±2)℃及(40±2)℃條件下的高溫影響因素試驗；90%±5%、75%±5%及65%±5%的高濕影響因素試驗；(30±2)℃、相對濕度(65±5)%條件下的加速試驗和(25±2)℃、相對濕度(60±10)%條件下長期試驗。樣品分組與評價方法如下：

2.3.1 光照影響因素試驗組 從20110301批中選取20片，除去外包裝，平鋪于開口容器中，放置于照度為4500lx±500lx的光照箱中。分別于0、5、10 d隨機取出樣品，對外觀性狀、融變時限、吸濕率、酶含量及重量差異進行評價。

吸濕率檢測方法，取檢測樣品，在0 d精密測定重量，在規定時間內再次精密測定重量，與0 d時樣品重量相比較，觀察樣品重量差異變化，得出吸濕增重率。

2.3.2 高溫影響因素試驗組 從20110301批中選取40片，除去外包裝，平鋪于開口容器中，分別放置于溫度為(60±2)℃及(40±2)℃的恒溫箱中，各20片。分別于0、5、10 d隨機取出樣品，對外觀性狀、融變時限、吸濕率、酶含量及重量差異進行評價。

2.3.3 高濕影響因素試驗組 從20110301批中選取60片，除去外包裝，平鋪于開口容器中，分別放置于濕度為90%±5%、75%±5%及65%±5%的恒濕密閉容器中，各20片。分別于0、5、10 d隨機取出樣品，對外觀性狀、融變時限、吸濕率、酶含量及重量差異進行評價。

2.3.4 加速試驗組 從20110301、20110302、20110401批中選取60片，共180片，用一容器按批次分區排放，放置于溫度為(30±2)℃、濕度為(65±5)%的恒溫恒濕培養箱內。于0月、1月、2月、3月及6月隨機取出樣品，對外觀性狀、融變時限、吸濕率、微生物限度及酶含量進行評價。其中微生物限度檢查項僅在穩定性試驗開始與結束時檢測。

2.3.5 長期留樣試驗組 從20110301，20110302，20110401批中隨機取80片，共240片，用一容器按批次分區排放，放置于溫度為(25±2)℃、濕度為(60±10)%的恒溫恒濕培養箱內。于0月、3月、6月、9月、12月、18月、24月、36月隨機取出樣品，對外觀性狀、融變時限、吸濕率、微生物限度、及酶含量進行評價，第24月，36月檢測發泡量。其中微生物限度檢查項僅在0月、12月、24月、36月時檢測。

3 結果與分析

3.1 樣品檢測

3.1.1 外觀性狀 20141101、20141102和20141103批次樣品均為片形一致，片面光潔、色澤均勻、質硬的類白色片劑。

3.1.2 鑒別 按照2010年版《中華人民共和國藥典》附錄VIIIB免疫斑點法，陽性結果應呈明顯色帶，陰性結果不顯色。結果如圖1所示。

圖1 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片免疫斑點法鑒別結果(1.陽性對照，2.樣品20141101，3.樣品20141102，4.樣品20141103，5.陰性對照)

3.1.3 酸堿度 20141101、20141102和20141103批次樣品酸堿度結果分別為6.9，6.9，7.0。符合質量標準設定的6.0～8.0。

3.1.4 融變時限、微生物限度、發泡量 20141101、20141102和20141103批次樣品融變時限、微生物、發泡量均符合獸藥典要求。

3.1.5 重量差異 20141101、20141102和20141103批次樣品重量差異均小于±2%，符合獸藥典要求。

3.2 含量測定 結果如表2所示。3批次樣品的酶含量均在標示量的80%～150%之間，符合擬定的質量標準。

表2 3批重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的含量測定結果

3.2.1 線性與范圍 結果如表3所示。反應體系中酶終濃度在0.2～1.0 U/mL范圍內具有很好的線性，因此，將測定的標準曲線范圍定為0.2～1.0 U/mL。

表3 3次線性范圍試驗結果(n=3)

3.2.2 準確性 結果如表4所示。用標準品制備標準曲線，以制備泡騰片樣品的同批次等量酶粉作為對照，測定泡騰片成品及泡騰片混合粉在泡騰后的酶含量，計算回收率，同時加入不同的測活體積，試驗了此方法測定溶葡萄球菌酶生物活性的準確性。由結果可見，測定方法的準確性高，加入不同的測活體積的結果無明顯差別，泡騰片成品的泡騰液經回算后回收率分別達到103%、99%、97%。

表4 三次試驗回收率結果(n=3)

3.2.3 試驗內精密度 結果如表5所示。同一試驗內不同濃度樣品測定的變異系數均<10%，表明測定方法一試驗內精密性高。

3.2.4 試驗間精密度 結果如表6所示。多次試驗間不同濃度樣品測定的變異系數均<10%，表明測定方法在多次試驗間的精密性高。

表5 不同加樣體積測定結果

表6 三次不同加樣體積的測定結果

3.2.5 專屬性 結果如表7所示。以不含溶葡萄球菌酶的空白泡騰片為對照，在泡騰片酶濃度測定正常的同時，空白泡騰片完全測不出有酶活性。表明測定方法的專屬性好。

表7 三次不同樣品的OD595測定值及酶含量(U/粒)

3.3 穩定性試驗結果

3.3.1 光照影響因素試驗結果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在4500±500lx光照強度下，10 d的考察期內，酶活性等各項指標無明顯變化。

3.3.2 高溫影響因素試驗結果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(60±2)℃高溫條件下，10 d的考察期內，酶活性有較明顯的下降，其他無明顯變化，(40±2)℃高溫條件下，10 d的考察期內，酶活性等各項指標無明顯變化。

3.3.3 高濕影響因素試驗結果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在95%±5%及75%±5%高濕條件下，10 d的考察期內，片劑外觀變不平整，吸濕重量增加明顯，酶含量有一定下降，其他指標無明顯變化，在65%±5%濕度條件下各項指標無明顯變化。實際生產中環境濕度都控制在低于65%以下。

3.3.4 加速實驗結果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(30±2)℃條件下，6個月的考察期內，外觀性狀、微生物、酶活性等各項指標無明顯變化。

3.3.5 長期實驗結果 重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片在(25±2)℃條件下，36個月的考察期內，外觀性狀、微生物、酶活性等各項指標無明顯變化。

4 討論與小結

含量測定方法學驗證試驗結果顯示，在色源底物法的測定條件下，反應體系中酶終濃度在0.2～1.0 U/mL范圍內具有很好的線性，相關系數均為99.9%以上，多次測定回歸曲線相關系數的CV<5%。因此，將測定的標準曲線范圍定為0.2～1.0 U/mL。且色源底物法測定的準確性好、精密性高、專屬性好，適宜于大量樣品的測定，可以用于重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的溶葡萄球菌酶生物活性的定量測定。

檢測結果顯示，重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片外觀形狀、鑒別、酸堿度、融變時限、微生物限度、發泡量、重量差異結果符合要求，含量測定為標示量的80%～150%。穩定性試驗結果表明：溫度、濕度是重組溶葡萄球菌酶泡騰片質量標準制訂和運輸保存必須考慮的關鍵指標；干燥、陰涼、密封是重組溶葡萄球菌酶泡騰片最佳保存溫度條件，并至少能保質24個月。

當前國內外對母豬陰道炎的治療方法主要有消毒劑治療，抗生素注入，或者兩者相結合治療。消毒劑沖洗常用1000 mg/mL高錳酸鉀或者500 mg/mL新潔爾滅沖洗陰道或者洗必泰栓給藥治療[7]?？股刈⑷雵鴥戎饕猛撩顾刈⑷雱?，國外則通常在分離致病菌后進行藥物敏感性測試再選用四環素類，磺胺類，青霉素類，氨基糖苷類或呋喃類抗生素[8-9]。消毒劑治療由于通常要進行大量沖洗，粘膜受刺激較大，外陰紅腫強烈且治療效果不佳?？股仡愃幬镏委煏种脐幍纼扔幸婕毦恼ＩL，破壞陰道內的微生態平衡，致病菌大量繁殖，增加了治療難度；而且長期使用抗生素，極易使致病菌產生耐藥性。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片作為一種生物酶制劑與抗生素、化學藥物有著完全不同的殺菌機理，沒有藥物殘留問題。重組溶葡萄球菌酶陰道泡騰片的研制為治療母豬陰道炎提供了一種新的選擇。

[1] Stephen P Hawser.Lysostaphin and clarithromycin: a promising combination for the eradication of Staphylococcus aureus biofilms[J].Letters to the Editor / International Journal of Antimicrobial Agents，2011,37 (6): 585-587.

[2] 林莉,王德容,陳勇,等.“蒲公英散”治療母豬陰道炎的療效觀察[J].畜牧市場,2010,5:50-52.

[3] Schmelcher，MAMPowell，SCBecker，etal.Chimeric phage lysins act synergistically with Lysostaphin to kill mastitis causingStaphylococcusaureusin murine mammary glands[J].Appl Environ Microbiol,2012,1:1-19.

[4] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2010年版一部[M].北京:中國農業出版社,2010.

[5] 中國藥典委員會．(2010)中華人民共和國藥典 2010年版三部[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010．

[6] 中華人民共和國農業部第1653號公告．重組溶葡萄球菌酶粉附2重組溶葡萄球菌酶活性測定法[S].

[7] 衛永明,吳國良,李光良.高錳酸鉀溶液結合抗生素治療母豬膿性陰道炎[J].上海畜牧獸醫通訊,1995，(5)：7．

[8] Maes,D.,M.Verdonck,A.D.Kruif.Vaginal microecology and vulval discharge in swine[M].Belgium.1999: 39-50.

[9] Oravainen J.Field studies on infectious reproductive diseases and lameness in sows[M].Helsinki:University of Helsinki，2008：1-37．

(編輯：侯向輝)

Quality Research of the Recombinant Lysostaphin Vaginal Effervescent Tablets

LU Min1，2，HUANG Qing-shan1，2，ZHANG Ji-en2*

(1．StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering，InstituteofGenetics，SchoolofSciencesFudanUniversity，Shanghai200433，China；2．KunShanBiogreenTechnologyCO.,Ltd,Kunshan,Jiangsu215316,China)

To assess the recombinant lysostaphin vaginal effervescent tablets，indicators,such as appearance，identification，pH,melt time,microbial limit,foam volume,weight variation,and assay,were investigated.In addition,the methodology of content determination was validated.And the stability of the tablet was investigated.The results showed that appearance，pH，melt time,microbial limit,foam volume,weight variation of the tablet were conform to the requirement.The content of the results was from 80% to 150% of labelled amount.Under the conditions of dry,cool and seal,the storage phase of the tablet reached at least 24 months.Thus it was confirmed that quality of the tablet was conform to the standard of the enterprise.

recombinant lysostaphin；vaginal effervescent tablets；quality research

國家星火計劃項目(2012GA690003)

陸珉，碩士研究生，工程師，從事生物酶制劑質量研究。

張繼恩。E-mail：jienzhang@163.com

2015-09-18

A

1002-1280 (2015) 12-0014-06

S852.61