植物內生木霉的鑒定及其抑菌活性

孫勇　蔣繼宏　張海燕

摘要：對分離自健康植物的6種內生木霉菌進行活化，再觀察菌落形態、顏色，測量生長速度，觀察孢子形態，測量孢子直徑范圍，進而對供試菌株進行分類鑒定。結果初步鑒定，DBs0-13為多孢木霉（Trichoderma polysporum），DBs57為里氏木霉（T. reesei），DBs66為長孢木霉（T. longipile），40為綠色木霉（T. viride），171為康氏木霉（T. koningii），292為哈茨木霉（T. harizianum）。采用生長速率法測定供試真菌發酵液（相當于稀釋10倍）對4種病原真菌的抑制效果。結果表明，6木霉菌對小麥赤霉菌、蘋果輪紋菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，其中DBs0-13和171的抑菌率相對較高，并對4種病原真菌都具有抑制作用；6種木霉菌中抑菌率最高的是DBs0-13，其對油菜菌核病菌、可可球二孢的抑制率分別為62.89%、41.12%。

關鍵詞：內生木霉菌；分類鑒定；形態特征；生長速率；病原菌；抑菌活性；生防菌

中圖分類號： S432.4+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0332-02

收稿日期：2014-04-11

基金項目：江蘇省徐州師范大學?；穑ň幪枺?0XLA20）。

作者簡介：孫勇（1977—），男，江西高安人，碩士，講師，從事應用微生物學研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蔣繼宏，教授。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。植物內生菌是一定階段或全部階段生活于健康植物組織和器官內部的真菌或細菌，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農藥、增產菌或作為潛在生防載體菌而加以利用[1]。木霉屬（Trichoderma）屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目黏孢菌類[2]，分布比較廣泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉菌是有效的生物農藥資源，適應性廣，生存能力強，對植物病原菌拮抗作用廣譜，在防病的同時還能產生多種酶分解土壤中的植物殘體、降解大分子化合物以便吸收利用，能與土壤中其他益菌協調生長、不污染環境等[3-5]。筆者在分離植物內生菌的過程中獲得了幾株植物內生木霉菌，鑒于木霉菌的生防特性，對分離到的內生木霉菌進行了分類鑒定和抗植物病原菌活性分析，為植物內生木霉菌的利用提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1材料來源6株木霉供試真菌（DBs0-13、DBs57、DBs66、40、171、292）分離自健康植物組織中，為徐州師范大學藥用植物重點實驗室保藏菌種。

1.1.2抑菌試驗用的病原真菌小麥赤霉病菌（Fusarium gramineaum Schwabe）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola）、油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]、可可球二孢菌（B. theobromae Pat.），均為徐州師范大學藥用植物重點實驗室保藏菌種。

1.1.3培養基馬鈴薯葡萄糖固體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH值自然；馬鈴薯葡萄糖液體培養基（發酵用的培養基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1木霉菌的活化將冷藏菌種取出，在無菌條件下用接種環挑取供試菌的少量菌絲（或0.5 cm×0.5 cm的菌落）至含PDA培養基的平板中，于28 ℃培養箱中培養3 d。

1.2.2木霉菌株生長速度的測定將活化過的木霉菌落用打孔器打孔，獲得的菌餅接于新培養基中，于28 ℃培養箱中培養3 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算出生長速度，同時觀察菌落顏色、形狀等。

1.2.3載玻片的培養將滅過菌的PDA培養基于微波爐中融化，待培養基溫度降到40～45 ℃時于超凈工作臺中倒平皿，要倒得盡量?。?.1～0.2 cm厚），待冷卻。在上述培養皿中挑取大約0.5 cm×0.5 cm的培養基于滅過菌的載玻片上，然后挑取培養皿中菌種的菌絲于瓊脂塊的3個角上，再蓋上滅過菌的蓋玻片，用記號筆輕輕敲1下，以免蓋玻片移動，在玻片上做好標記，于28 ℃培養箱中培養3 d左右（整個過程都要保證無菌狀態）。

1.2.4顯微特征觀察取出培養3 d后的玻片，置于顯微分析儀的操作臺上，用針尖輕輕挑起蓋玻片的一側，慢慢地拿起蓋玻片，并輕輕地挑掉周圍的培養基，在新的載玻片中央滴1滴甲基藍，蓋玻片的一側先接觸液體，然后慢慢地放下蓋玻片，用濾紙吸取周圍多余液體，置于顯微鏡下觀察，觀察菌絲以及孢子并進行拍攝，同時使用測微尺測量孢子的大?。ㄩL和寬都要測）。每個菌株的孢子各測30個，記錄數據。

1.2.5木霉菌發酵液（相當于稀釋10倍）的制備于 500 mL 三角瓶中加入100 mL的PDA液體培養基，包扎，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，無菌條件下用接種針挑取適量活化木霉菌株的菌絲，接種于三角瓶中的培養基中，置于28 ℃的搖床上150 r/min培養7 d，獲得各菌株的發酵液，發酵液4 000 r/min離心5 min，取上清液，再在無菌狀態下用022 μm濾膜過濾除菌，濾液分別裝于滅菌錐形瓶中。

1.2.6抑菌效果的測定將PDA固體培養基加熱至熔化，室溫靜置，待培養基溫度降到60 ℃左右時，將木霉菌發酵液與培養基按照體積比1 ∶9充分混勻，混勻后立刻倒平板，在無菌操作臺上室溫放置至凝固，即制成含發酵液的平板，以不加發酵液的PDA平板為對照。從培養好的4種病原真菌菌落上，用滅過菌的打孔器沿邊緣打出直徑為0.4 cm的圓形菌塊，將菌塊分別轉接至已凝固的培養基平板表面，并設3個重復，以無發酵液平板為對照，置于25 ℃培養箱下培養3 d。用十字交叉法測定菌落直徑并記錄數據，根據以下公式計算抑菌率：抑菌率=（對照菌落直徑-發酵液處理后的菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。endprint

2結果與分析

2.1木霉菌菌落形態和顯微形態描述

供試木霉菌得菌落形態和孢子等特征見圖1、表1，根據這些特征初步鑒定，DBs0-13為多孢木霉（T. polysporum）、DBs57為里氏木霉（T. reesei）、DBs66為長孢木霉（T. longipile）、40號為綠色木霉（T. viride）、171為康氏木霉（T. koningii）、292為哈茨木霉（T. harizianum）。表1木霉菌相關形態特征

2.2供試木霉對病原真菌的抑制作用

由表2可知，多孢木霉菌DBs0-13和171康氏木霉對4種病原真菌都有抑菌作用；其他4種木霉菌（DBs57、DBs66、40、292）除對小麥赤霉病菌沒有抑制作用外，對其他病原菌也有較強的抑制作用。對小麥赤霉病菌抑制作用最強的是171；對蘋果輪紋病菌抑制作用最強的是40，抑菌率為4885%；對油菜菌核病菌、可可球二孢菌抑制作用最強的是DBs0-13，抑菌率分別為62.89%、41.12%。綜合抑菌結果可知，在所有供試木霉中DBs0-13的抑菌效果最好，是值得開發的生防菌。

3結論

6種內生木霉菌對蘋果輪紋菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，而對小麥赤霉菌基本上不具有抑制作用（除了DBs0-13和171號木霉菌），與空白對照相比成負抑制狀態，很有可能對小麥赤霉菌的生長反而具有促進作用。其中，DBs0-13具有比較高的抑菌率，而且其抑菌范圍較寬，是比較好的生物農藥資源，可以作田間試驗以進一步開發利用。

參考文獻：

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[3]李梅云，譚麗華，方敦煌，等. 哈茨木霉的培養及其對煙草疫霉生長的抑制研究[J]. 微生物學通報，2006，33（6）：79-83.

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[5]劉連妹. 綠色木霉HT01的生物學特性和抑菌特性[J]. 西北農業學報，2008，17（6）：179-183.唐梅，龔明福，羅燕，等. 抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌內生細菌KLXD06粗蛋白的提取[J]. 江蘇農業科學，2015，43（2）：334-335.endprint