殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑的制備及在硅橡膠基體上的應用

康 虹,馬森源,高向華,宋秀龍,李閑閑,魏麗喬

(太原理工大學 a.新材料界面科學與工程教育部重點實驗室,b.材料科學與工程學院,太原 030024)

殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑的制備及在硅橡膠基體上的應用

康 虹a,馬森源a,高向華b,宋秀龍a,李閑閑a,魏麗喬a

(太原理工大學 a.新材料界面科學與工程教育部重點實驗室,b.材料科學與工程學院,太原 030024)

采用化學法合成了一種殼聚糖/銀-銅(CAC)共混的復合抗菌劑,利用表面官能團鏈接方式接枝到硅橡膠基體上,制成抗菌硅橡膠高分子材料。通過SEM、TEM、XPS等測試方法對抗菌硅橡膠進行表征分析,采用抑菌環法和震蕩燒瓶法表征復合抗菌劑和抗菌材料的抗菌性能。結果表明,CAC復合抗菌劑其細菌存活率對大腸桿菌僅達到18%,對金黃色葡萄球菌為26%,其初始分解溫度較CS/Ag溶膠提高了大約70 ℃,具有良好的抗菌性和熱穩定性;制備的抗菌硅橡膠高分子材料方法簡單,成本低廉,其抗菌功能層厚度約為50～70 μm,且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率均達到96%以上,抗菌性能優良。

殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑;抗菌硅橡膠;抗菌性能

近些年,隨著現代醫療技術的不斷發展,醫用介入導管被廣泛使用。其中導尿管的利用率相對較大,但大部分導尿管會因其長期留置而導致患者相關性尿路感染,直至死亡[1-2]。為此,研制性能優良的抗菌劑,并將其接枝到基體,制備一種抗菌醫用高分子材料是當今醫療領域的研究重點之一[3-4]。殼聚糖(CS)是一種在自然界廣泛存在且含量較多的多糖[5]。馬瀅發現，改性后的殼聚糖對細菌的抑菌效果增強了[6]，原因是具有生物相容性和活潑的官能基團,易于與其他金屬粒子螯合,形成金屬配合物[7];而且殼聚糖安全無毒可降解,能被廣泛應用在醫療器械和飲用水凈化等領域。但是,殼聚糖單獨使用時,抗菌性能較差,所以在抗菌性能要求比較高的情況下不能單獨作為一種抗菌劑使用。銀(Ag)的抗菌廣譜性和抗菌效果比其他金屬都要高,當降低銀的粒徑,達到納米級時,因為納米材料具有某些特殊的表面性能和表面效應,使得抗菌效果有更大提高。王婧討論了殼聚糖/納米銀復合抗菌溶膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌性能[8],安靖探討了殼聚糖載銀納米微球對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌同樣有較高的抗菌性[9]。但是,銀本身價格比較昂貴,另外,近些年來研究者對其大量使用而帶來的毒性研究也越來越多[10-11]。而銅在自然界中廣泛存在,且是一種重要的微量元素(存在于大多數生物體中,且環保又相對便宜)[12-13]，其抗菌效果僅次于銀。朱曉紅發現，殼聚糖/銅能增強對某些植物病原菌的抑制作用[14]。

筆者擬采用少量銅來替代一部分銀,制備出一種綠色環保、價格低廉、抗菌性能優良的復合抗菌劑,并將其接枝到醫用高分子材料硅橡膠的表面,形成抗菌功能涂層。采用JSM-6700F型場發射掃描電子顯微鏡(FSEM)、PHI 1600 ESCA型X射線能譜儀(XPS)和接觸角測試儀等，對抗菌硅橡膠的微觀形貌、化學結構和親疏水性等進行表征分析,利用抑菌環法和震蕩燒瓶法對其抗菌性能進行測定。

1 實驗

1.1 材料與試劑

殼聚糖(CS),浙江玉環海洋生物化學有限公司生產;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，硝酸銀、硝酸銅、PBS、乙醇等其他試劑均為分析純;硅膠，南晨生硅橡膠股份有限公司生產。

1.2 殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑(CAC)的制備

將1 mmol/L的 AgNO3和0.5 mmol/L的Cu(NO3)2按設計比例溶于100 mL去離子水中,在一定溫度下攪拌2 h；然后加入0.5 g殼聚糖(CS)固體粉末,在一定溫度下恒溫攪拌0.5 h,得到抗菌劑懸濁液；在常溫下進行抽濾、干燥、研磨,最終得到淡藍色粉末狀抗菌劑[15]。

1.3 抗菌硅橡膠的制備

首先將一定尺寸的硅橡膠懸掛,并用丙酮、鹽酸等化學試劑進行表面清洗,主要是去除表面的污漬。之后將其置于紫外輻射下進行表面活化,激發硅橡膠表面的活性基團,以備抗菌劑能與之結合。最后將樣品在制備好的抗菌劑中進行浸泡,一定時間、溫度之后取出干燥[16],最終得到抗菌硅橡膠。

1.4 殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑(CAC)對細菌的抑菌性能

本文參照日本標準JIS Z2801—2010[17],大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為試驗菌,復抗菌劑采用計算細胞存活率和菌環法評定其抗菌性能,抗菌硅橡膠測定采用震蕩燒瓶法表征其抗菌活性,并計算抑菌率。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑的工藝參數優化及其結構表征

2.1.1 工藝參數對CAC復合抗菌劑抗菌性能的影響

圖1-a和1-b分別為不同反應溫度下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環抑菌效果圖。從圖中可以看出，溫度梯度為40→50→60 ℃ 時,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環直徑分別為11 mm和12 mm,遠遠大于日本衛生標準的7 mm，說明抑菌效果良好。其原因是梯度的反應溫度提供了遞增的能量,使得硝酸銀分散較好,也易形成小粒徑的銀單質。比較恒溫40 ℃和50 ℃的結果,也可以看出升高溫度有利于提高還原反應的速度,增加了反應體系中納米顆粒的成核率,從而形成更多的納米顆粒[18]。所以升高一定的反應溫度可以使粒徑變小,且不會發生團聚現象。當反應溫度達到60 ℃時,抗菌劑中的粒子會發生劇烈的碰撞,且殼聚糖發生降解,導致銀離子很難與殼聚糖發生螯合。所以選擇溫度梯度為40→50→60 ℃為制備CAC復合抗茵劑的最佳反應溫度。

從圖1-c和1-d中可以看出，當硝酸鹽摩爾比n(AgNO3)∶n(Cu(NO3)2)=1∶3時,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環直徑分別為11 mm和9 mm,其抑菌效果良好。其原因是在此比例下,硝酸銅過量會使Ag+更多地與殼聚糖分子中的氨基發生反應,從而獲得更多的單質銀。

a，c，e-大腸桿菌；b，d，f-金黃色葡萄球菌圖1 不同工藝條件的CAC復合抗菌劑的抑菌環效果圖Fig.1 Inhibition zones of CAC at different process conditions against(a，c，e-E.coli；b，d，f-S.aureus)

從圖1-e和1-f中可以看出,粒徑大小會對抗菌劑的抗菌性能產生影響,主要是因為抗菌劑粒徑較小,與細菌接觸時的比表面積會增大,從而加大殺死細菌的幾率。

綜上所述,制備CAC復合抗菌劑的最佳工藝條件為:溫度梯度為40→50→60 ℃,n(AgNO3)∶n(Cu(NO3)2)=1∶3,粒徑較小時,抗菌性能最優。

2.1.2 CAC復合抗菌劑的微觀表面形貌

圖2-a 顯示為優化后的CAC復合抗菌劑的掃描電鏡照片。圖中可以明顯看出其外觀結構致密,呈大塊片層狀,且表面存在均勻的顆粒狀物質。通過XPS元素分析可見Ag、Cu、C、N和O等元素(圖2-b)的峰值出現,從而可以確定此制備過程發生了還原反應,有單質銀或者是銅的顆粒生成。

圖2 CAC復合抗菌劑的SEM圖(a)和XPS元素譜圖(b)Fig.2 SEM image (a) and XPS element pattern (b) of CAC

圖3為優化后CAC復合抗菌劑的透射電鏡照片。圖中可以看到，顆粒狀物質均勻分散在基體表層上,形狀多為球形或類球形,無團聚現象。其原因是此制備過程并沒有改變殼聚糖本身的片層結構,這種結構可以充當穩定劑[19],從而避免顆粒的團聚。

圖3 不同放大倍數下的CAC 復合抗菌劑的TEM 圖像Fig.3 TEM micrographs of CAC under different magnification

2.1.3 CAC復合抗菌劑的晶體結構分析

圖4所示為CAC復合抗菌劑的XRD譜圖。CAC復合抗菌劑在2θ=19.6°，44.3°處有吸收峰。19.6°是殼聚糖的吸收峰,44.3°是銀的吸收峰。用公式D=Kλ/Bcosθ計算出此晶面間距是0.201 nm,是銀的(200)晶面。表明所制得的抗菌劑中有納米銀粒子,且制備過程并沒有改變納米銀的晶體結構。

這里的K是謝樂常數,等于0.89;λ等于0.154 056 nm;B是吸收峰的半峰寬,θ是吸收角度。

圖4 CAC復合抗菌劑的XRD譜圖Fig.4 XRD spectrum of CAC antibacterial agent

2.1.4 CAC復合抗菌劑的熱穩定性分析

圖5所示是CS/Ag溶膠和CAC復合抗菌劑的熱穩定性能的譜圖。由圖可知,CS/Ag溶膠的初始分解溫度為65 ℃,而CAC復合抗菌劑的初始分解溫度為135 ℃。很明顯，加入銅之后的抗菌劑熱穩定性提高了大約70 ℃。其原因是殼聚糖特殊的片層狀結構,且加入銅之后的殼聚糖基體表面更致密,使得結構更穩定。這一性能可以應用于耐溫抗菌材料的領域,從而擴展了抗菌劑的應用范圍,對材料的發展有更重要意義。

圖5 CS/Ag溶膠和CAC復合抗菌劑的TGA曲線圖Fig.5 TGA curves of CS/Ag colloidal sol and CAC composite antibacterial agent

2.1.5 CAC復合抗菌劑的抗菌性能

圖6為使用CAC復合抗菌劑分別對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細菌存活率。從大腸桿菌的細菌存活率中(6-a)可以看出,其細菌的存活率為18%,抗菌性能優良;從金黃色葡萄球菌的細菌存活率中(6-b)也可以看到細菌存活率較低,僅有26%,說明CAC復合抗菌劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌性。將兩圖同向對比,可以得知CAC復合抗菌劑對大腸桿菌比金黃色葡萄球菌的抗菌能力要強。

圖6 CAC復合抗菌劑對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的細菌存活率Fig.6 Degree of microbial growth (%) for E. coli (a) and S. aureus (b) when using the CAC antibacterial agent

2.2 抗菌硅橡膠的結構及其抗菌性能

2.2.1 抗菌硅橡膠的微觀形貌

圖7為接枝CAC復合抗菌劑后硅橡膠的表面與斷面SEM圖像。由圖7-a可以看出,基體表面抗菌涂層致密并且平整,可以看到細小的微球狀物質堆砌在表面。由圖7-b可以明顯地看到，厚度大約為50 μm的抗菌涂層與基體結合緊密,且抗菌涂層覆蓋了整個基體表面。

圖7 抗菌硅橡膠的SEM圖像(a-表面；b-斷面)Fig.7 SEM images of antibacterial silicone rubber (a) on the surface (b) on the cross-section

2.2.2 抗菌硅橡膠的XPS分析

通過XPS曲線確定元素的種類和價態。由圖8-a可以看出,抗菌涂層中的各元素的法向分量表現為峰(Ag 3d) (圖8-b)，(Cu 2p)(圖8-c)，(Si 2s)、(Si 2p) (圖8-d)。分析單個元素的XPS譜圖，由圖8-b中得知，(Ag 3d)有明顯的兩個峰值,歸因于(Ag 3d)3/2(372.7 eV) 和(Ag 3d)5/2(368.0 eV)兩個軌道,其代表的是Ag+和Ag0兩個價態；利用XPS Peak軟件將其進行分峰擬合,用分峰后的面積公式計算得到單質銀所占比例為70%,因此銀主要以單質銀存在于基體中[20]。圖8-c中可以看到,在結合能為937.7 eV處有一個強特征峰,其代表的是Cu2+的信號,造成鍵結合能有偏差的原因可能是抗菌劑自身pH值、制備溫度和其他金屬對其的影響[21]，此制備過程沒有改變銅的價態,Cu2+主要是充當抗菌有效成分。

將抗菌硅橡膠中各元素的含量計算結果列于表1中,從表中可以看出銀和銅的含量(質量分數)分別為0.17%和1.67%,雖然其含量較少,但仍可說明有抗菌成分銀和銅結合到硅橡膠基體中[22],這與EDS譜圖的分析結果相吻合。

a-抗菌硅橡膠；b-Ag元素；c-Cu元素；d-Si 元素圖8 CAC復合抗菌劑接枝硅橡膠后的XPS譜圖Fig.8 XPS spectrograms of antibacterial silicone rubber a,element Ag b,element Cu c and element Si d

表1 抗菌硅橡膠的元素分析

2.2.3 抗菌硅橡膠的接觸角測試分析

圖9所示為硅橡膠和抗菌硅橡膠的接觸角測試結果。圖9-a所示的硅橡膠接觸角為106°,而圖9-b的抗菌硅橡膠的接觸角為87°,其接觸角明顯下降,樣品表面由疏水性變成了親水性。其原因是接枝CAC復合抗菌劑后,抗菌劑上的親水性基團—OH和—NO3對硅橡膠的影響,所以CAC復合抗菌劑改善了硅橡膠的親水性,從而擴大了硅橡膠在醫用制品中的應用范圍。

圖9 接觸角測試的試驗結果 (a-硅橡膠；b-抗菌硅橡膠)Fig.9 Contact angle measurements of (a) Silicone rubber (b) antibacterial Silicone rubber

2.2.4 抗菌硅橡膠的抗菌性能震蕩燒瓶測試

利用震蕩燒瓶實驗法測試其抑菌率,所選用的測試菌種是大腸桿菌與金黃色葡萄球菌,測試結果見表2所示。樣品對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌率均大于96%,顯示出較高的抑菌水平。

3 結論

1) 本實驗制備CAC復合抗菌劑的最佳工藝條件為:溫度梯度為40→50→60 ℃,n(AgNO3)∶n(Cu(NO3)2)=1∶3；其細菌存活率對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌僅達到18%和26%；初始分解溫度較CS/Ag溶膠提高了大約70 ℃,具有良好的抗菌性和熱穩定性。

2) 采用該工藝制得的CAC復合抗菌劑中,銀主要是以納米級的單質銀存在,起主要抗菌作用。

3) 將CAC復合抗菌劑接枝到硅橡膠表面制成抗菌硅橡膠,其抗菌功能層厚度約為50～70 μm。

4) 由于親水性基團—OH和—NO3的加入，使得硅橡膠表面由疏水性變為親水性,且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均達到96%以上,抗菌性能良好,可用于醫療治療的橡膠抗菌導管制作,廣泛應用于醫療衛生領域。

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(編輯：龐富祥)

Preparation of Chitosan/silver-copper Composite Antibacterial Agent and Its Application on Silicone Rubber Matrix

KANG Honga,MA Senyuana,GAO Xianghuab,SONG Xiulonga,LI Xianxiana,WEI Liqiaoa

(a.KeyLaboratoryofInterfaceScienceandEngineeringinAdvancedMaterialsof
TaiyuanUniversityofTechnology,MinistryofEducation;b.CollegeofMaterialsScienceandEngineering,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan030024,China)

In this paper, Chitosan/Silver/Copper (CAC) antibacterial agent was prepared by chemical reduction, an antibacterial polymer material of silicone rubber was obtained by grafting surface functional groups onto silicone rubber matrix. The sample was characterized by scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM),and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The antibacterial activity of composite antibacterial agents and antibacterial materials was characterized by inhibition zones and shake flask tests. Finally, the conclusion was：the degree of microbial growth of CAC against E.coli and S.aureus is only 18% and 26% respectively,the initial decomposition temperature of CAC is about 70 ℃ higher than that of CS/Ag colloidal sol, CAC antibacterial agent exhibits high antibacterial activities and thermal stability;The preparation process for the antibacterial silicone rubber is simple and inexpensive,the thickness of antibacterial function layer is about 50-70 μm, the antibacterial ratio is above 96% for E.coli and S. aureus,with excellent antibacterial activities.

antibacterial agent;antibacterial silicone rubber;antibacterial activity

1007-9432(2015)05-0489-06

2015-03-23

山西省科技項目資助：醫用納米抗菌導管材料的開發(800104-02010005)

康虹(1989-)，女，內蒙古包頭市人，碩士生，主要從事抗菌材料、高分子材料表面改性的研究，(E-mail)18334704725@163.com，(Tel)18334704725

馬森源，男，教授，主要從事環保型阻燃、防火材料的研究，(E-mail)senyuanma@hotmail.com，(Tel)13466828636

TB333

A

10.16355/j.cnki.issn1007-9432tyut.2015.05.002