植物酯酶應用于有機磷農藥殘留分析技術的研究進展

劉彥釗，席會平，江 飛

（1.河南質量工程職業學院，河南 平頂山 467000；2.武漢理工大學 資源與環境學院，湖北 武漢 430070）

隨著我國農業的高速發展，農藥的環境污染問題越來越嚴重，由此帶來很多的問題.人體攝入的硝酸鹽有81.2%來自受農藥污染的蔬菜，而硝酸鹽是國內外公認的致癌物亞硝胺的前體物，長期食用會導致癌癥、動脈硬化、心血管病、胎兒畸形、死胎、早夭、早衰等疾病.絕大多數人食用有害蔬菜后并不馬上表現出癥狀，毒物在人體中富集，時間長了便會釀成嚴重后果.一個值得注意的傾向——近年來，癌癥的發病率越來越高，且日趨年輕化，這在很大程度上與食用受污染蔬菜有關.如何檢測與控制農藥在食品中的殘留成為一個關系到國民健康的重要問題.

目前我國使用的農藥主要種類為有機磷農藥.而有機磷農藥殘留分析技術有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、色譜/質譜聯用技術（GC/LC-MS）、毛細管電泳法（CE）、酶抑制法、免疫分析法（Immunoassay，IA）、生物傳感器法和速檢法等［1］.GC、HPLC、GC/LC-MS具有高選擇性，但是操作繁瑣、耗時長、成本高、并且要求對樣品進行預濃縮和衍生處理，難以得到廣泛的應用［2-3］.而成本相對低廉的酶抑制法、免疫分析法、生物傳感器法等方法則具有比較廣闊的應用前景［4-5］.

最早發展起來的酶分析技術采用的酶基本是從動物如果蠅或電鰻中提取的［6］.但是，動物酯酶提取困難而且保存條件苛刻.相對來說，植物酯酶來源廣泛，提取容易且易于保存［7］.

1 植物酯酶的酶源

由于植物酯酶的活性受酶源的影響較為明顯，如酶源的品種、批次等都會對檢測結果的重現性產生影響，所以有必要研究植物酯酶的酶源.

康天放等［8］采用離心提取法從四種小麥中提取了粗酶液，并采用分光光度法測定了植物酯酶的催化效率.結果表明，不同品種植物種子的酯酶對有機磷農藥的敏感度有所不同.在研究的四種小麥中，以京2小麥最適合用于對硫磷的分析，檢測的最低限值可以達到3.0×10-7mg/L.

雷明等［9］對不同來源的12種植物材料進行了植物酯酶的提取和分析，以篩選出高活性的酶源.研究發現，在所有材料中以花豇豆的酶活力最強，明顯比其他酶源得到的酯酶活性要好.為了進一步了解花豇豆酯酶的活性，作者用花豇豆酯酶進行了6種農藥的檢測，檢測結果表明，采用花豇豆酯酶進行分析檢測，最低檢測限均小于國家規定的范圍，非常適合于植物酯酶抑制法的分析，其酯酶的總活力、比活力、活力及其敏感性在所實驗的十幾種植物中是最為理想的.

阮長青等［10］從同一植物的不同材料，同一材料的不同部位及同一部位不同生長期的植物體中提取了植物酯酶，并對這些酯酶的活力進行了研究，發現種子一旦發芽或長成幼苗，則其酯酶活性迅速下降.他們同時研究了不同植物種子酯酶的活性，并結合對同一種子的不同部位提取的植物酯酶進行橫向對比，最終證實龍麥26號小麥的種子中的麩片提取的酯酶的活性最高.

王亞飛等［11］對多種不同來源的植物酯酶進行了篩選研究，發現花豇豆總酯在有機磷農藥殘留分析中具有活性高、靈敏度好的特點，花豇豆可以作為一種理想的植物酯酶來源植物.

劉洋等［12］從馬鈴薯、紅薯、茨菇、芋頭四種塊莖植物中提取植物酯酶，并將自制的植物酯酶運用到酶抑制法分析有機磷農藥的研究中，結果表明四種不同來源的植物酯酶在有機磷農藥殘留分析中均有比國家檢測標準更高的靈敏度，適宜于作為有機磷農藥殘留檢測用酶.

不同種屬的植物的不同部位均可以進行植物酯酶的提取.但是，酶源的活性影響因素較為復雜.不同種屬植物制得的酯酶活性不同，同一種屬但不同品種活性也不相同，同一種屬同一品種不同部位活性也不相同，即便以上都相同，制備方法不同其活性也會有差異.總的來說，植物酯酶源種的活性研究還處于摸索階段，只能發現現象，對實驗現象的解釋還不夠.所以目前植物酯酶源種研究的一個重要方向是尋找植物酯酶活性的普遍規律以指導植物酯酶源種的選擇.若能完善相關理論，則必能找到一種超高活性植物酯酶的源種，而植物酯酶的靈敏度、檢出限都將會被優化，在有機磷農藥殘留分析領域的應用前景將會更加廣闊.

2 植物酯酶的提取、純化及固化工藝

植物酯酶的提取工藝直接關系到酶的活性以及在酶抑制分析中的靈敏度，而酶的純化則有利于提高酶的活性.固化工藝則可以使酶固定化，便于儲存和使用，非常適合于現場快速分析.

2.1 植物酯酶的提取工藝

多數文獻中植物酯酶提取方法往往采用離心分離法.在離心分離時要根據欲分離物質以及雜質的大小、密度和特性的不同選擇適當的離心機.而離心機有常速（≤8 000r/min）、高速（10 000～25 000 r/min）、超高速（25 000～80 000r/min）之分，所以使用離心分離法進行植物酯酶提取時應進行轉速的合理選擇.然而，目前離心分離轉速選擇對酶活性的影響還未見有研究.此外，超高速離心機可以進行植物酯酶的純化，不過目前還未見有國內文獻使用此方法.

李紹中等［13］根據鹽溶液提取法的原理，研發了一種從小麥中提取植物酯酶的新工藝.他們發現，在提取的過程中加入適量呈電中性的鹽類物質可以顯著提高酶的溶解度和活性，他們采用新的實驗方法優化了提取工藝，得到提取酯酶的最佳條件：采用含NaCl的溶液作為提取劑，提取溫度為4℃，提取時間為60min.

王振宇等［14］研究了提取小麥酯酶的工藝.根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理研究了鹽濃度、時間和溫度等條件，在此基礎上建立了小麥酯酶后行的二次回歸模型，并得出了該工藝的最佳條件：鹽濃度為0.164mol/L，溫度為37.27℃，提取時間101.21min.

王亞飛等［15］研究了從苜蓿中提取植物酯酶的工藝方法，并考察了提取條件對酯酶活性的影響.結果表明，最佳的提取條件：緩沖溶液為0.1mol/L磷酸鹽，pH＝7.0，溫度為40℃.

酶的提取方法對酶的活性影響很大，如采用有機溶劑提取法會使酶的活性嚴重損失.故研究出便捷、酶存活率高、成本低的提取方法至關重要.常見的酶的提取方法有鹽溶液提取法、有機溶液提取法、酸溶液提取法、堿溶液提取法和離心分離法等.其中有機溶液提取法酶活性較低，多不采用；酸堿溶液提取法適用范圍較窄，所以一般采用的是離心分離法和鹽溶液提取法.

2.2 植物酯酶的純化

植物酯酶的純化工藝主要有篩膜分離法、選擇性沉淀法、電泳分離法、選擇性熱變性法、親和層析法和聚焦層析法等.

周艷明等［16］研究了層析工藝在植物酯酶純化中的應用.他們采用了Q-Sepharose-Fast Flow陰離子層析法進行純化，純化倍數高達16.814倍.同時采用葡聚糖G-200薄層凝膠層析法及高效液相色譜證明了純化效果，并確定了此法的最佳操作條件.

溫艷霞等［17］以磷酸緩沖液提取了大豆的植物酯酶.采用離心分離、鹽析純化、離子交換層析純化等方法得到了高純度的大豆酯酶.他們研究了該大豆酯酶的活性最佳條件：溫度30℃，pH＝7.5；同時發現大豆酯酶的活性隨離子強度的改變而發生變化.

徐禮鵬等［18］提出了在植物酯酶純化工藝中應用超濾膜技術，證明了超濾膜技術應用于純化植物酯酶工藝的可行性.

植物酯酶提取之后的粗酶液中除了含有目標酶之外往往還存在著很多雜質，包括大分子的核酸、其他蛋白質、以及一些小分子物質.進行純化可以除去這些雜質，從而使酶的活性得以提升，這有利于進一步提高植物酯酶在有機磷農藥分析時的靈敏度.植物酯酶純化方法雖然多種多樣，但是較常使用的有鹽析法、非離子型聚合物沉淀法、凝膠層析法、親和層析法和電泳法等.由于粗酶液中的成分較復雜，進行純化時單獨采用某一種技術往往效果不是特別理想，而常采用上述方法的組合，如含有的核酸可以使用硫酸魚精蛋白進行沉淀然后低溫離心除去，粘多糖多采用離子型表面活性劑進行去除，而小分子物質可以采用過濾法去除等.

2.3 植物酯酶的固化

游離態的酶具有穩定性差、無法重復使用、混入產品中難以分離等缺陷.為了克服這一缺陷，發展出了模仿人體酶的作用方式將酶進行固定化的技術，并且酶固定化之后仍保持了酶的高催化性.因此，上個世紀60年代后期，酶固定化技術迅速地發展起來.雖然酶的固定化技術發展迅速，但是到目前為止真正能投入工業生產的固定化酶只有為數不多的十幾種，故酶固定化技術還需進一步的研究和發展.

周艷明等［19］采用冷凍干燥法對植物酯酶進行固化，最終將酯酶制成了干粉.他們對固化工藝條件進行了研究.研究結果表明，酶液厚度過大會使干燥時間延長，但是對酶的活力并沒有顯著的影響；而在冷凍干燥固化的過程中向酶液中添加5%的聚乙二醇可對酶進行保護，防止其失活.

許娟等［20］利用硝酸纖維素膜（NC）對植物酯酶的固定化進行了研究，探討了固化過程工藝條件的優化，并研究了固定化之后的植物酯酶對四種農藥殘留的敏感性.固化過程工藝條件為：游離酶20 μL，濃度為0.05%的戊二醛溶液2μL，最佳酸度7.0，采用緩沖溶液穩定該溶液的pH，最佳溫度4℃，在此條件下固定8h即得到固定化酶片.該固定化酶片的最佳活性條件：溫度35℃，pH為8.0，均高于游離態的粗酶液.最后將游離態酶液與固定化酶的敏感性進行了對比研究，發現在檢測4種農藥時，固定化酶的敏感度均高于游離態酶的，他們認為，固定化酶比游離態的酶液更適合于農藥的快速檢測.

明雪杰［21］以甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）為單體，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，甲醇水溶液為致孔劑，采用懸浮聚合法制備了GMA-NVP-MBA多孔聚合物微球，并將該微球作為載體應用于植物酯酶固定化工藝中.結果表明，該載體在植物酯酶固定化中十分具有優勢，具有廣闊的應用前景.

植物酯酶用于農藥殘留檢測中存在一個很突出的問題.雖然其價格低廉、制備簡單、適合現場操作，但是若均采用酶液進行分析則存在著存儲不方便的問題，這將制約植物酯酶在農藥殘留檢測中的應用.所以固定化酶是今后植物酯酶應用的一個最重要的途徑.若制成固定化的檢驗盒，并能投入工業化生產，則將成為一個快速、便捷、高效的檢測手段.

3 植物酯酶應用于農殘分析的方法

目前基于植物酯酶的分析方法主要有酶抑制法和生物傳感器法.

3.1 植物酯酶分光光度法

近年發表的基于酯酶抑制的分光光度法的研究文獻占到了植物酯酶應用的絕大部分.

于基成等［22］依據植物酯酶抑制的原理，采用顯色分光光度法研究了一種有機磷農藥殘留快速檢測方法，確定了檢測時的最適宜條件，在此基礎上，以聚苯乙烯反應板為載體進行有機磷農藥的快速檢測，最低檢測限為0.245μg.

邱會東等［23］采用α-乙酸萘酯為底物，三氯化鐵溶液為顯色劑，在植物酯酶的作用下α-乙酸萘酯發生水解生成萘酚和乙酸，而萘酚遇到三氯化鐵可進一步與之化合生成紫色絡合物.由于植物酯酶的活性可受到微量有機磷農藥的抑制，故若樣品存在微量殘留有機磷農藥則會使水解程度變小，從而使萘酚生成量減少，溶液的紫色變淺.作者詳細研究了各種因素對檢測反應的影響.通過5種農藥的檢測，驗證了此法的可行性，他們認為，該法在農藥殘留量于0.001～0.250mg/L范圍內，相對偏差較小，分析精度較高，而加標回收實驗驗證此法的加標回收率可以達到87%～93%.

王亞飛等［24］根據植物酯酶抑制原理，以2，6-二氯乙酰靛酚為顯色劑，建立了一種快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留的方法，通過對反應條件的研究確立了檢測方法的最佳條件.他們采用此法對5種有機磷農藥殘留進行了詳細的分析，分析知該法的最低檢測限范圍為0.002～0.05mg/L.

趙永福等［25］將植物酯酶抑制原理與熒光分光光度法結合建立了一種新型的分析方法.該法中采用乙酸-1-萘酯為底物，以植物酯酶催化底物分解產生一種熒光物質——萘酚.在該反應體系中加入β-環糊精可增強萘酚的熒光強度，從而使分析的靈敏度得以提高.該法的線性相關系數高，說明此法的精度比較高，可以作為植物酯酶抑制分光光度法的一個補充.

朱秋兵等［26］介紹了酶抑制分光光度法在基層檢測蔬果農殘中的應用及基本原理，比較了國家標準與行業標準的異同，闡述了酶抑制分光光度法的前處理及分析注意事項.

潘建文［27］簡述了酶抑制分光光度法目前在農藥殘留分析中的應用，分析了此法的優勢及需要注意的問題.

劉亞平等［28］對本地多種蔬菜中的4種農藥殘留量進行了植物酯酶抑制分光光度法分析，結果表明，植物酯酶抑制分光光度法對氧化樂果檢測靈敏度低，對敵百蟲、呋喃丹、毒死蜱檢測靈敏度高.

目前國內在進行植物酯酶抑制法測定農藥殘留時，除了趙永福在文獻［25］中采用熒光分光光度法分析之外，多數采用與紫外-可見分光光度計聯合使用，并且使用的酶多采用未經固化的粗酶液.但是，粗酶液不易保存，且分光光度計不易攜帶，故不利于現場檢測的開展.

3.2 植物酯酶生物傳感器法

酶傳感器是最早出現的生物傳感器.1962年CLARK等提出了酶傳感器原理，1967年UPDIKE等依據這一理論制成了酶電極，將酶電極與酶固定化技術相結合制成的傳感器稱為酶傳感器.

欒崇林等［29］采用溶膠凝膠法將植物酯酶包埋在凝膠中，干燥之后得到有機磷的傳感膜.將此膜與光纖器件耦合得到一種有機磷光纖生物傳感器.以此傳感器對7種有機磷農藥進行基于酶抑制原理的分析檢測，結果表明，此植物酯酶生物傳感器對0.010～10.000mg/L濃度范圍內的農藥殘留具有較高的分析精度，回收率較高，相對標準偏差較小，且檢測過程穩定不易受干擾.此傳感器可以應用于有機磷及氨基甲酸酯的現場檢測.

姜彬等［30］采用離心分離法從小麥中提取了植物酯酶，純化之后作為生物傳感器的酶源.以四氨基銅酞菁/單碳納米管/GC修飾電極為基體電極，采用氣相沉積法制備得TiO2凝膠，將植物酯酶包埋入此凝膠中，干燥后即制得植物酯酶生物傳感器.具有諸多優點，精確度高，且檢測下限較低，有較強的實際應用價值.

朱赫等［31］介紹了近年來農藥殘留快速分析用酶生物傳感器的類別，主要包括膽堿酯酶、酪氨酸酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化物酶、有機磷水解酶和谷胱甘肽巰基轉移酶等，可直接用于農藥殘留的快速檢測.

4 植物酯酶抑制法實驗條件的研究

目前植物酯酶抑制法多采用的酶是粗酶液，酶液中成分復雜，并且游離態的酶穩定性差，實驗條件的細微改變就會導致活性的很大差別，從而影響到分析的結果.也正因為如此，國內文獻中對于植物酯酶抑制法實驗條件優化的研究層出不窮.

欒崇林等［32］采用均勻設計法對植物酯酶抑制法測定有機磷農藥殘留的檢測條件進行了優化，通過7種農藥的測定，確定了最佳的反應條件，并通過檢測蔬菜樣品中農藥殘留驗證了最佳條件.

張寧［33］采用兩種不同的固定方式對植物酯酶進行固化處理，對比了不同固化方式對固化酯酶敏感度的影響.他們將固化酯酶應用于農藥殘留的實驗條件進行了優化.得出以下結論：固化方式以離子交換法為好，而固化酶在檢測中的最佳pH為4.8，最適宜溫度與游離酶相當，固化酶活力受溫度影響較為顯著.

趙永福等［34］測試了5種表面活性劑對植物酯酶抑制分析中顯色反應的増敏作用.確定十二烷基硫酸鈉（SDS）對分析中的顯色反應的増敏作用可達到70%，同時對影響顯色反應的因素進行了研究.

黃保宏等［35］研究了溫度對植物酯酶的影響規律，發現溫度對酶活性影響比較顯著，并確定了植物酯酶的最佳活性溫度為45℃.

劉春紅等［36］研究了以α-乙酸萘酯和固藍B鹽為顯色體系的酯酶活力的最佳反應條件，在α-乙酸萘酯濃度為0.015mol/L時，最佳pH為6.5，最佳溫度為40℃，最佳抑制劑濃度為3%，最大吸收波長為535nm.

陳士恩等［37］研究了牛肉中有機磷農藥殘留分析過程的最佳條件：36.8℃，pH＝7.7，反應時間3 min，顯色劑2，6-二氯靛酚，最大吸收波長606nm.

曾孟祥等［38］研究了反應條件對酶促反應活性的影響，建立了酶抑制方程，確立了反應的最佳條件；發現多種金屬離子對酶促反應具有激活作用，尤其是Cu2＋和Co2＋離子.

有關實驗條件的研究各有側重，主要的實驗條件有：pH、溫度、酶濃度、增敏劑、最大吸收波長、農藥類型、顯色劑類型和酶的存在形式等.由此可見植物酯酶活性在實際應用中受到的影響因素比較多，充分地研究各種因素對酶的活性的影響對植物酯酶抑制分析法的實際應用具有一定的指導意義.

5 問題與展望

目前植物酯酶應用于農藥殘留技術中主要存在以下問題：

植物酯酶酶種的選擇問題.目前酶種的選擇處于一種摸索的狀態，雖然許多研究者也研究了多種植物的種子提取酶的工藝和活性對比，卻沒有酶種選擇的相關理論的建立，無法有效地指導實際工作.

植物酯酶的固定化問題.大部分的研究工作都是圍繞著酶抑制分光光度法來進行，所以在植物酯酶的應用中，固定化研究相對來說較少.而實際上，酶固定化之后酶的壽命和便利性都比酶液的要好.

植物酯酶的分析方法問題.采用植物酯酶抑制法進行研究的較多，其他方法較少，意味著植物酯酶在分析檢測上的用途較為單一.此外，該法與其他分析方法結合的相關研究也較少.

植物酯酶在使用中的問題.酶液的使用壽命有限，實際使用過程中需現配現用；酶活性的干擾因素多，不易控制；不同農藥對不同植物酯酶的抑制情況較為復雜；顯色劑不穩定容易受到外界條件的干擾.雖然目前已經有固定化酶的出現，但是應用卻不盡如人意，且固定化酶制作過程中酶的性能和結構都會發生改變.

大力發展固定化酶技術，將酶的固定化技術與其他新型快速的檢測技術有機地結合起來將是今后一個重要的研究方向.

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