基因的克隆、序列特征及時間特異性表達

李小玉+張曉峰+杜偉+聶浩+唐壯+班月圓+杜小龍+程嘉翎

摘要：SAUR是生長素早期響應基因，能夠被生長素快速誘導表達，本研究從桑樹綠枝扦插的插穗基部皮層中克隆得到個桑樹SAUR家族基因，命名為MaSAUR2（GenBank登錄號：KC85288）。該基因序列全長 86 bp，ORF全長549 bp，編碼82個氨基酸，蛋白質分子質量為20 700，無信號肽與跨膜區域，在第82 aa至38 aa之間有個保守的SAUR-specific結構域。桑樹綠枝插穗基部經吲哚-3-乙酸（IAA）誘導處理，插穗基部皮層[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達水平在5 min內顯著上升；在綠枝扦插生根過程中，不定根長出皮層時[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因表達量顯著升高。推測 MaSAUR2 參與了桑樹扦插過程中不定根的形成。

關鍵詞：桑樹；MaSAUR2基因；基因克??；序列特征；實時定量CR

中圖分類號： S8882；Q9432文獻標志碼： A[HK]

文章編號：002-302（204）2-0034-04

植物激素在調控植物生長發育中具有十分重要的作用。而生長素普遍存在于高等植物中，在植物頂端優勢的保持、植物的向光性、側根與不定根的形成與發育、組織和器官的形成與發育等過程中發揮重要作用。由生長素在短時間內快速誘導且表達上調的基因，稱為生長素早期響應基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3類[2]。在這3類生長素早期響應基因家族中，能夠被生長素快速、強烈地誘導表達的是SAUR基因家族成員中的大多數基因[2]。SAUR基因編碼的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之間[3]。在生長素處理的 2～5 min 之內，這些mRNAs就會被很快合成[4-6]，這表明生長素在SAUR基因的轉錄調控中發揮著重要作用。

第個SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次發現[5]，隨后陸續從綠豆[7]、豌豆[8]、擬南芥[9]、煙草[0]、蘿卜、蘋果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及馬鈴薯[6]中鑒定出一系列SAUR基因。其中擬南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、馬鈴薯中分別有72、58、7、43、99、34個SAUR基因家族成員[2，6，4-6]。這些基因中大多數不含內含子[6，6]，這可能便于其對外界快速作出應答。盡管已從不同物種中鑒定或預測出許多SAUR基因，但目前只有它們中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表達于延伸組織中[7-9]，說明SAUR基因在細胞伸長過程中有著特殊功能。有報道稱SAUR蛋白會在鈣離子存在條件下與鈣調蛋白結合，說明其可能作為第二信使介導生長素信號轉導與鈣/鈣調蛋白之間的聯系[3]。在擬南芥中過量表達SAUR9-24[2]會造成植株的根呈波浪狀，子葉下胚軸變長，葉片變大，為SAUR是植物細胞伸長過程中的重要調節劑提供直接證據[20]。目前關于桑樹SAUR家族基因的研究還沒有報道。本研究根據Solexa mRNA測序技術構建的 cDNA 文庫中獲得的序列設計引物，在桑樹綠枝插穗基部皮層中克隆得到條SAUR家族基因的cDNA序列，依據與其他物種同源序列對比結果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。對該序列的結構特征進行了生物信息學分析。根據SAUR是植物細胞伸長過程中的重要調節劑[20]，推測該基因在扦插生根過程中發揮作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根誘導劑，因此使用熒光實時定量CR技術（real-time qRT-CR）檢測[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑樹綠枝插穗基部經IAA誘導后的表達變化，及其在綠枝扦插生根過程中不同時期的表達情況，以期對該基因的功能研究提供依據。

材料與方法

材料及主要試劑

供試桑樹品種為育7-，保存于中國農業科學院蠶業研究所試驗桑園。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體CR產物克隆試劑盒、一步法制備高效感受態細胞試劑盒、Ecoli DH5α均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物設計委托上海伯豪生物技術有限公司通過Solexa mRNA測序技術構建桑樹旺盛生長期綠枝扦插生根過程的cDNA文庫。從中獲得段序列，經Blast同源對比推斷為SAUR家族基因。根據所得序列的開放閱讀框設計引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑樹總DNA、RNA提取及CR擴增取0 g桑樹莖部皮層，參照CTAB法[2]提取基因組DNA。取0 g桑樹莖部皮層，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取總RNA。電泳檢測RNA質量，紫外分光光度計測定DNA與RNA的D260 /D280值計算DNA與總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板，Oligo（dT）為引物進行反轉錄。將模板與引物在RNase free ddH2O中混勻，65 ℃中溫浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混勻后42 ℃溫浴 40 min，再經70 ℃溫浴0 min，之后冰浴保存，得第鏈cDNA。分別以DNA和第鏈cDNA為模板進行CR擴增，反應體系為25 μL，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30個循環；72 ℃ 7 min。CR擴增產物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，與pUCm-T載體連接，轉化Ecoli DH5α感受態細胞，藍白斑篩選，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

3桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和編碼蛋白質序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分別分析cDNA的堿基組成、開放閱讀框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分別在線分析目的基因編碼蛋白質的理化性質和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分別對蛋白質的跨膜區、信號肽、亞細胞定位以及結構功能域進行預測。蛋白質的二級結構與三級結構的預測分別使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]來完成。同源性比對使用NCBI網站及ClustalX8多序列對比分析軟件進行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距離法構建系統進化樹。

4桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因誘導表達的實時定量CR檢測

選取桑樹品種育7-母株上生長健壯、無病蟲害的當年生均一的半木質化綠枝枝條，剪成5 cm長的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分別于2、5、0、30、60 min時取插穗基部 cm內的皮層作[2]為試驗材料，以未浸泡IAA的插穗作為對照，試驗材料置于液氮中速凍，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue試劑盒提取各個材料的總RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第鏈。應用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300熒光定量CR儀（ABI公司）進行熒光實時定量CR檢測。根據[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，設計實時定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑樹Maactin（GenBank登錄號為：DQ785808）為內參照，引物為AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反應程序：50 ℃ 2 min；95 ℃變性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45個循環。重復3次。使用2-ΔΔCT處理數據。

5桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中表達的熒光實時定量CR檢測

于7月下旬，選取育7-生長健壯、無病害的半木質化枝條剪成長約5 cm的插穗，應用程嘉翎等的發明專利技術[25]進行扦插試驗。每2 d取插穗基部 cm內的皮層（不含愈傷組織和新根）為試驗材料，對[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根發育過程中的表達情況進行檢測，重復3次。

2結果與分析

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

從cDNA文庫中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括個 549 bp 的開放閱讀框（ORF）以及597 bp的5′端與40 bp的3′端部分序列。使用設計的引物分別以DNA和cDNA為模板進行CR，擴增產物經0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示均為一條約550 bp的片段，與預期相符（圖）。將目的片段切膠回收，與pUCm-T載體連接，轉化感受態細胞，各挑選4個陽性克隆進行測序，結果與拼接對比序列結果一致。將該基因命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登錄號：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白質的序列分析

對獲得的基因序列進行分析，結果（圖2）表明：該cDNA全長 86 bp。該cDNA含有個549 bp的完整的開放閱讀框，編碼82個氨基酸殘基。所編碼的蛋白質分子質量約為 20 700，理論等電點pI為939。SAUR2蛋白疏水性的最小值為-3733，最大值為344；親水區域為8～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水區域為82～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。預測分析顯示，該蛋白質沒有信號肽與跨膜區域，蛋白位于細胞核中。通過SMART預測，該蛋白質第82 aa至38 aa之間有個保守的結構功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER預測可知，該蛋白質二級結構組分中，α-螺旋占379%，β-折疊占8%，無規則卷曲占538%，為混合型蛋白。應用HYRE2對該蛋白質進行三級結構預測，因沒有SAUR蛋白三級結構模板，預測結果的覆蓋率與可信性都較低，因此不采納。

23桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼氨基酸的同源性與系統進化分析

根據桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸序列，從NCBI選取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20軟件進行同源性多序列比對分析（圖3）。結果表明，該基因與毛果楊（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亞種Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻風樹[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸的同源性分別為63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同時表明參與對比的7條同源序列在結構域附近保守性強。

根據[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推導的氨基酸序列，從NCBI數據庫中下載其他6個物種的氨基酸同源序列，使用MEGA5軟件進行系統進化分析。結果（圖4）表明，桑樹與桃、草莓亞種Vesca的親緣關系最近，聚為一類。

24實時定量CR檢測桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的誘導表達

桑樹插穗經IAA誘導處理后，莖部皮層中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表達量明顯增加，5 min后表達量達到最高，之后表達量下降（圖5）。

25實時定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中的表達變化

在插穗生根過程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達在基部膨大期維持在一個較低的水平，而在不定根形成期，該基因的表達量顯著上升（圖6）。

3結論

本試驗從桑樹中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，該序列全長 86 bp，包括549 bp的開放閱讀框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，沒有內含子。根據用Blast軟件與其他物種基因相比對的結果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。該基因所表達的蛋白質與其他物種SAUR蛋白相似度不是很高，這與其他物種中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。該蛋[CM（25]白沒有信號肽與跨膜區域，亞細胞定位于細胞核中，在第

植物激素在調控植物生長發育中具有十分重要的作用。而生長素普遍存在于高等植物中，在植物頂端優勢的保持、植物的向光性、側根與不定根的形成與發育、組織和器官的形成與發育等過程中發揮重要作用。由生長素在短時間內快速誘導且表達上調的基因，稱為生長素早期響應基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3類[2]。在這3類生長素早期響應基因家族中，能夠被生長素快速、強烈地誘導表達的是SAUR基因家族成員中的大多數基因[2]。SAUR基因編碼的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之間[3]。在生長素處理的 2～5 min 之內，這些mRNAs就會被很快合成[4-6]，這表明生長素在SAUR基因的轉錄調控中發揮著重要作用。

第個SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次發現[5]，隨后陸續從綠豆[7]、豌豆[8]、擬南芥[9]、煙草[0]、蘿卜、蘋果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及馬鈴薯[6]中鑒定出一系列SAUR基因。其中擬南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、馬鈴薯中分別有72、58、7、43、99、34個SAUR基因家族成員[2，6，4-6]。這些基因中大多數不含內含子[6，6]，這可能便于其對外界快速作出應答。盡管已從不同物種中鑒定或預測出許多SAUR基因，但目前只有它們中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表達于延伸組織中[7-9]，說明SAUR基因在細胞伸長過程中有著特殊功能。有報道稱SAUR蛋白會在鈣離子存在條件下與鈣調蛋白結合，說明其可能作為第二信使介導生長素信號轉導與鈣/鈣調蛋白之間的聯系[3]。在擬南芥中過量表達SAUR9-24[2]會造成植株的根呈波浪狀，子葉下胚軸變長，葉片變大，為SAUR是植物細胞伸長過程中的重要調節劑提供直接證據[20]。目前關于桑樹SAUR家族基因的研究還沒有報道。本研究根據Solexa mRNA測序技術構建的 cDNA 文庫中獲得的序列設計引物，在桑樹綠枝插穗基部皮層中克隆得到條SAUR家族基因的cDNA序列，依據與其他物種同源序列對比結果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。對該序列的結構特征進行了生物信息學分析。根據SAUR是植物細胞伸長過程中的重要調節劑[20]，推測該基因在扦插生根過程中發揮作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根誘導劑，因此使用熒光實時定量CR技術（real-time qRT-CR）檢測[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑樹綠枝插穗基部經IAA誘導后的表達變化，及其在綠枝扦插生根過程中不同時期的表達情況，以期對該基因的功能研究提供依據。

材料與方法

材料及主要試劑

供試桑樹品種為育7-，保存于中國農業科學院蠶業研究所試驗桑園。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體CR產物克隆試劑盒、一步法制備高效感受態細胞試劑盒、Ecoli DH5α均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物設計委托上海伯豪生物技術有限公司通過Solexa mRNA測序技術構建桑樹旺盛生長期綠枝扦插生根過程的cDNA文庫。從中獲得段序列，經Blast同源對比推斷為SAUR家族基因。根據所得序列的開放閱讀框設計引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑樹總DNA、RNA提取及CR擴增取0 g桑樹莖部皮層，參照CTAB法[2]提取基因組DNA。取0 g桑樹莖部皮層，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取總RNA。電泳檢測RNA質量，紫外分光光度計測定DNA與RNA的D260 /D280值計算DNA與總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板，Oligo（dT）為引物進行反轉錄。將模板與引物在RNase free ddH2O中混勻，65 ℃中溫浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混勻后42 ℃溫浴 40 min，再經70 ℃溫浴0 min，之后冰浴保存，得第鏈cDNA。分別以DNA和第鏈cDNA為模板進行CR擴增，反應體系為25 μL，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30個循環；72 ℃ 7 min。CR擴增產物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，與pUCm-T載體連接，轉化Ecoli DH5α感受態細胞，藍白斑篩選，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

3桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和編碼蛋白質序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分別分析cDNA的堿基組成、開放閱讀框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分別在線分析目的基因編碼蛋白質的理化性質和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分別對蛋白質的跨膜區、信號肽、亞細胞定位以及結構功能域進行預測。蛋白質的二級結構與三級結構的預測分別使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]來完成。同源性比對使用NCBI網站及ClustalX8多序列對比分析軟件進行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距離法構建系統進化樹。

4桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因誘導表達的實時定量CR檢測

選取桑樹品種育7-母株上生長健壯、無病蟲害的當年生均一的半木質化綠枝枝條，剪成5 cm長的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分別于2、5、0、30、60 min時取插穗基部 cm內的皮層作[2]為試驗材料，以未浸泡IAA的插穗作為對照，試驗材料置于液氮中速凍，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue試劑盒提取各個材料的總RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第鏈。應用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300熒光定量CR儀（ABI公司）進行熒光實時定量CR檢測。根據[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，設計實時定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑樹Maactin（GenBank登錄號為：DQ785808）為內參照，引物為AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反應程序：50 ℃ 2 min；95 ℃變性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45個循環。重復3次。使用2-ΔΔCT處理數據。

5桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中表達的熒光實時定量CR檢測

于7月下旬，選取育7-生長健壯、無病害的半木質化枝條剪成長約5 cm的插穗，應用程嘉翎等的發明專利技術[25]進行扦插試驗。每2 d取插穗基部 cm內的皮層（不含愈傷組織和新根）為試驗材料，對[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根發育過程中的表達情況進行檢測，重復3次。

2結果與分析

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

從cDNA文庫中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括個 549 bp 的開放閱讀框（ORF）以及597 bp的5′端與40 bp的3′端部分序列。使用設計的引物分別以DNA和cDNA為模板進行CR，擴增產物經0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示均為一條約550 bp的片段，與預期相符（圖）。將目的片段切膠回收，與pUCm-T載體連接，轉化感受態細胞，各挑選4個陽性克隆進行測序，結果與拼接對比序列結果一致。將該基因命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登錄號：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白質的序列分析

對獲得的基因序列進行分析，結果（圖2）表明：該cDNA全長 86 bp。該cDNA含有個549 bp的完整的開放閱讀框，編碼82個氨基酸殘基。所編碼的蛋白質分子質量約為 20 700，理論等電點pI為939。SAUR2蛋白疏水性的最小值為-3733，最大值為344；親水區域為8～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水區域為82～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。預測分析顯示，該蛋白質沒有信號肽與跨膜區域，蛋白位于細胞核中。通過SMART預測，該蛋白質第82 aa至38 aa之間有個保守的結構功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER預測可知，該蛋白質二級結構組分中，α-螺旋占379%，β-折疊占8%，無規則卷曲占538%，為混合型蛋白。應用HYRE2對該蛋白質進行三級結構預測，因沒有SAUR蛋白三級結構模板，預測結果的覆蓋率與可信性都較低，因此不采納。

23桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼氨基酸的同源性與系統進化分析

根據桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸序列，從NCBI選取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20軟件進行同源性多序列比對分析（圖3）。結果表明，該基因與毛果楊（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亞種Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻風樹[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸的同源性分別為63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同時表明參與對比的7條同源序列在結構域附近保守性強。

根據[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推導的氨基酸序列，從NCBI數據庫中下載其他6個物種的氨基酸同源序列，使用MEGA5軟件進行系統進化分析。結果（圖4）表明，桑樹與桃、草莓亞種Vesca的親緣關系最近，聚為一類。

24實時定量CR檢測桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的誘導表達

桑樹插穗經IAA誘導處理后，莖部皮層中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表達量明顯增加，5 min后表達量達到最高，之后表達量下降（圖5）。

25實時定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中的表達變化

在插穗生根過程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達在基部膨大期維持在一個較低的水平，而在不定根形成期，該基因的表達量顯著上升（圖6）。

3結論

本試驗從桑樹中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，該序列全長 86 bp，包括549 bp的開放閱讀框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，沒有內含子。根據用Blast軟件與其他物種基因相比對的結果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。該基因所表達的蛋白質與其他物種SAUR蛋白相似度不是很高，這與其他物種中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。該蛋[CM（25]白沒有信號肽與跨膜區域，亞細胞定位于細胞核中，在第