正交設計優化芒果SRA—CR反應體系及引物篩選

趙英　付海天　周俊岸　李日旺　莫永龍　張宇　黃國弟

摘要：以芒果基因組DNA為模板，采用正交試驗對模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進行3因素5水平正交試驗優化。結果表明，相關序列擴增多態性CR（sequence related amplified polymorphism，SRA-CR）最佳反應體系為：30 ng 模板DNA、03 μmol/L 引物、0 μL 2×Taq CR Master Mix，總體積為25 μL。運用該體系對0份芒果種質材料進行驗證，證明該體系穩定可靠，并從00對引物組合中篩選出擴增條帶清晰、多態性豐富的36對引物組合。

關鍵詞：芒果；SRA標記；正交試驗設計；體系優化；引物篩選

中圖分類號： Q9432；S667703文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-004-03

芒果（Mangifera indica L）為漆樹科常綠果樹，是著名的熱帶亞熱帶水果，享有“熱帶果王”之美譽，為世界五大名果之一。近年來由于我國芒果種質資源的深入挖掘利用以及芒果育種的進步，特別是國外引進品種的增多，芒果種質資源日益豐富，為芒果的品種創新奠定了堅實的基礎，同時也對芒果遺傳多樣性鑒定和新品種測試與保護工作提出了新的挑戰。

相關序列擴增多態性（sequence related amplified polymorphism，SRA）是Li等于200年發明的一種新的標記技術。該技術集隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAD）和擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFL）技術的優點于一體，具有簡單、穩定、在基因組中分布均勻等優點。目前已應用于蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲堅果[2]、菠蘿、桃、花生[3]、番木瓜[4]等，但至今尚未見SRA分子標記應用于我國芒果遺傳多樣性分析、分類鑒定等方面的報道。[3]筆者在開展芒果遺傳多樣性及其親緣關系研究的過程中發現，SRA-CR條件的變化會得到不同的結果，影響芒果的遺傳多樣性評價，因此構建適用于芒果的SRA-CR體系至關重要。

[3]本試驗以0份芒果種質為材料，借鑒其他作物的研究成果，就影響芒果SRA-CR反應的因素進行探索，建立了適合芒果SRA分析的反應條件及體系，旨在為芒果種質資源鑒定和創新、分子標記輔助育種等提供技術幫助，為近一步開展芒果種質資源遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構建奠定基礎。

材料與方法

試驗材料

參試芒果種質共0份，均采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質資源圃。選取芒果健康植株上的無病蟲嫩葉，采摘洗凈后于-70 ℃保存，反應體系的優化以金煌芒DNA為模板完成，供試品種見表。

2試驗方法

2DNA的提取和檢測芒果基因組DNA的提取參照何新華等的CTAB法[5]，并稍加改良，利用0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，根據樣品D260 nm/D280 nm計算DNA純度，根據D260 nm值計算樣品DNA的濃度，并稀釋至0 ng/μL，于-20 ℃保存備用。

22SRA-CR反應條件參考Li等所用引物[，6]，設計0條正向引物和0條反向引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。選用引物Me9與Em9進行體系優化，試驗重復2次。擴增程序：94 ℃預變性 min，35 ℃退火 min，72 ℃延伸5 min，5個循環；94 ℃預變性 min，50 ℃ 退火 min，72 ℃ 延伸 5 min，35個循環；72 ℃延伸0 min，4 ℃保存備用。CR產物用20%瓊脂糖凝膠在 05×TBE 電泳緩沖液中、85 W條件下電泳5 h，采用核酸染料染色法進行條帶檢測。電泳結束后，于凝膠成像系統上檢測并拍照，依照擴增條帶的敏感性與特異性，即條帶的強弱及雜帶的多少來判斷各體系的優劣。

24優化體系的穩定性檢測及引物篩選隨機選擇6對SRA引物組合對優化體系進行驗證，確定芒果SRA-CR的最佳反應體系和擴增條件，并對00條引物組合進行CR擴增，篩選多態性引物。

2結果與分析

2芒果基因組DNA的檢測結果

DNA的提取質量是決定SRA-CR擴增效果的關鍵因素之一。本試驗以芒果嫩葉為材料，對0份芒果種質材料的基因組DNA 進行提取，最后得到的DNA呈透明絮狀，電泳后條帶清晰，無拖尾現象（圖）。經分光光度計測定，所用DNA樣品的D260 nm/D230 nm值均在20～25之間，D260 nm/D280 nm 值均在7～9之間，表明所提取的DNA質量較高，符合試驗要求。

[FK（W0][TZYtif][FK）]

22正交試驗設計的SRA-CR擴增結果分析

由圖2可見，25個芒果正交試驗處理的SRA-CR擴增結果存在著一定的差異。從2次重復試驗的結果來看，、6、0、4、5、22號處理譜帶少且不清晰，4、5、8、9、2、3與7號組合的譜[2]帶清晰，亮度、重復性好。綜合擴增條帶的數目、強弱、清晰度、可分辯率與節約成本等指標，確定組合8號是比較理想的擴增模式體系，即25 μL反應體系中含30 ng DNA，03 μmol/L 引物，25 μL 2×Taq CR Master Mix。

23引物篩選

以隨機選取的芒果DNA作模板，用00對引物進行CR擴增，從中選擇擴增條帶清晰、穩定且多態性高的適合芒果種質鑒定的引物進行正式擴增。根據擴增條帶的多少、清晰度、穩定性和多態性高低，最終從所合成的00對引物中篩選出36對引物用于SRA擴增（表5）。

24SRA 優化體系在不同芒果種間的擴增

根據上述試驗的優化結果，隨機選取Me6與Em引物組合來對0份芒果種質的DNA進行擴增，以進一步驗證該擴增反應體系的效果。由圖3可以看出，引物Me6與Em不

但對0份芒果種質均能擴增出較好的條帶，而且也存在著很明顯[CM（25]的多態性條帶，由此說明所優化的擴增體系比較可靠，適合芒果種質的SRA分析研究。

3結論與討論

CR反應體系的優化方法主要有3種：單因素試驗、均勻試驗和正交試驗優化。正交試驗設計相對單因素試驗而言具有試驗次數較少、效用明確且能較快地獲得極佳的試驗結果的特點，避免了單一因素試驗結果的不足。目前，正交試驗設計已成功應用于棗、價廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反應體系優化[7]，但在芒果上還未曾見報道。本試驗通過正交設計，對影響芒果SRA 反應體系的模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進行了優化，建立了適用于芒果的最優SRA反應體系，即25μL反應體系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同時，在00個引物組合中，共得到多態性引物組合36個。該反應體系及36個多態性引物組合可用于芒果種質遺傳多樣性分析、系統發育和育種應用等方面，同時也為芒果品種鑒定、親緣關系分析及優良新品種的選育等提供技術參考。

影響SRA-CR反應的因素相對復雜，不同植物適應的SRA 反應體系不同，且各因素之間存在著相互效應，只有各因子之間的濃度配比達到最佳狀態時才能得到穩定、可重復的擴增結果。因此，SRA標記應用到不同物種上時需要優化反應體系和條件。在芒果SRA 體系優化的過程中，發現DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物濃度等均會影響SRA擴增效果，但模板DNA含量對擴增無明顯影響（20～60 ng 之間均有穩定的擴增），這與其他學者的研究結果相似[2，8-0]?？梢?，對芒果SRA 反應條件進行優化是非常必要的。

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