微小RNA對骨重塑和炎癥性骨吸收調控的研究進展

Progress research on regulation of microRNA on bone remodeling and inflammatory bone resorption

［文獻標志碼］A

［文章編號］1671－587Ⅹ（2015）01－0195－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150138

［收稿日期］2014－05－29

［基金項目］國家自然科學基金資助課題（81271111）

［作者簡介］孫宏晨（1964－），男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，醫學博士，高分子化學與物理學博士后，主要從事頜骨重塑機制以及納米材料與轉基因治療方面的研究。

［通信作者］孫宏晨，教授，博士研究生導師（Tel：0431－88796010，E－mail：hcsun＠mail.jlu.edu.cn）

人體骨骼系統終生都能通過骨形成和骨吸收過程不斷進行重塑，并受多種因素影響。慢性炎癥如牙周炎、風濕性關節炎等均可以通過干擾骨代謝導致骨質的吸收破壞 ［1］。目前普遍采用促進成骨細胞性骨形成、抑制破骨細胞性骨吸收的治療策略維持機體的骨重塑平衡。miRNA是一類起源于內源性轉錄物、由18～22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，通過抑制靶mRNA的翻譯或增強靶mRNA的降解來調控轉錄后水平基因表達 ［2］，在細胞增殖、分化、凋亡和代謝等生物學功能上具有重要的作用，并進一步參與細胞分化、組織發育、器官形成以及疾病發生 ［3－4］。研究 ［1］表明：miRNA不僅參與了炎癥反應，而且通過多個信號通路對成骨細胞和破骨細胞等的增殖、定向分化和功能維持發揮調控作用。miRNA還通過調控炎性因子的表達進一步參與成骨細胞和破骨細胞介導的炎癥性骨吸收。因此，以miRNA為靶點、不僅對闡明骨破壞性疾病的發生機制具有重要的理論意義，而且對治療骨相關性疾病亦具有重要的臨床意義。

1　miRNA的形成及作用機制

除Y染色體，人類其他染色體上均能發現轉錄為miRNA的基因序列。miRNA的啟動子受表觀遺傳和轉錄因子的調控。機體內miRNA的合成需要經過多個步驟，包括轉錄、初級miRNA轉錄本（primary miRNA，pri－miRNA）的加工、運輸至胞漿、miRNA前體（precursor miRNA，pre－miRNA）的加工、復制鏈的選擇和靶定轉錄等，這種嚴格的多步合成過程有助于確保只有具備正確序列和結構的miRNA才能調控基因的表達 ［5］。

miRNA的基因來自于編碼蛋白或非編碼蛋白的內含子或獨立編碼miRNA的基因序列。在細胞核內，miRNA基因序列首先經RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ轉錄產生具有莖環結構的初級轉錄產物pri－miRNA ［6］。在哺乳動物中，primiRNA在RNaseⅢ核酸內切酶Drosha與DiGeorge綜合征關鍵區基因8（Drosha－DiGeorge syndrome critical region gene　8，DGCR8）復合物作用下，加工成為60～100nt的發夾狀pre－miRNA，繼而在轉運蛋白Exportin　5的協助下從核內運輸至胞質中 ［7］。在細胞質中，另一種RNaseⅢ核酸內切酶Dicer與其搭檔蛋白TRBP（Dicer－TAR RNA binding protein）所形成的復合物對pre－miRNA進行切割，產生結構類似于小干擾RNA的二聚體（雙鏈miRNA） ［8］。RNA誘導的沉默復合體（RNA－induced silencing complex，RISC）由Dicer酶、TRBP、PKR的蛋白活化劑（protein activator of PKR，PACT）和Ago蛋白組成，雙鏈miRNA 與RISC結合后被解旋酶分成兩條鏈，其中一條是成熟的miRNA引導鏈，而另一條互補的隨從鏈miRNA＊則立即降解 ［8］。見圖1（插頁四，圖中紅色標記部分為成熟的miRNA鏈）。

miRNA與RISC復合物發揮抑制靶mRNA作用的方式取決于miRNA和靶mRNA之間的配對程度。成熟miRNA 的5′端具有與靶mRNA的3′非翻譯區（3′untranslated region，3′UTR）特異互補的“種子序列（seed region）”，這種靶向結合能引導靶mRNA的降解或抑制其翻譯 ［9］。若miRNA與靶mRNA的堿基完全配對，則核酸內切酶Ago2降解靶mRNA，此過程可能發生在RNA加工小體中（processing bodies，P－body）；然而，若含有膨隆部分的miRNA和靶mRNA以不完全配對的形式結合則會引起翻譯抑制，此為脫腺苷化作用的結果 ［10］。多數mRNAs的翻譯起始是由于其5′帽端的m7G被真核翻譯起始因子eIF4E識別所引起的。目前有研究 ［11］表明：RISC中的Ago蛋白成分其中心區域有著與eIF4E帽結合區同源的序列，能夠與eIF4E競爭發揮翻譯抑制的作用。

2　骨重塑和炎癥性骨吸收

成骨細胞和破骨細胞是參與骨吸收和骨形成過程的重要細胞。有研究 ［12］顯示：多能間充質干細胞通過Runx　2、成骨細胞特異性轉錄因子（osterix，OSX）和β－鏈蛋白（β－catenin）等轉錄因子的調控向成骨細胞分化。單核細胞／巨噬細胞系統通過巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）、RANKL、腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素（IL）等轉錄因子的調控向破骨細胞分化。當活化的成骨細胞在吸收陷窩中分泌新的骨基質時，能夠通過骨保護素（osteoprotegerin，OPG）／核激活因子受體（receptor activation of NF－κB，RANK）／核激活因子受體配體（Ligand of receptor activation of NF－κB，RANKL）軸的作用，參與破骨細胞分化的負性調控過程，從而引起骨重塑的發生 ［13］。一旦破骨細胞達到高度活躍的程度或成骨細胞分泌的骨基質不足以填補吸收陷窩時就會干擾骨重塑的平衡，引起骨量減少或骨質疏松癥 ［1］。

但是，骨重塑的平衡常被炎癥因子打破，在炎癥條件下，免疫系統產生的炎癥因子如TNF、IL－1和IL－6等不僅能使炎癥反應持續發生，還能顯著增強破骨細胞的生成和功能，從而激活骨吸收途徑，抑制骨重建。盡管破骨細胞的激活和分化主要依賴成骨細胞產生的M－CSF和RANKL，但TNF、IL－1和IL－6的存在能顯著增強破骨細胞的生成和功能 ［14］。因此炎癥反應間接參與了局部或系統性骨質流失的發生。

3　miRNA對骨重塑的直接調控作用

3.1　調控骨髓間充質干細胞（bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）向成骨細胞分化的miRNA BMMSCs是一類具有自我更新能力的多能干細胞，不僅可沿包括成骨細胞在內的多個譜系方向分化，還能夠對多種環境因素作出應答 ［15］。胞外信號調節激酶（extracellular signal－regulated kinase2，ERK）通路在骨形成調控過程中發揮重要作用，包括對Runx2／Cbfa－1的磷酸化作用及誘導OSX基因表達等。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信號通路與胞外基質蛋白激活的ERK1／2信號通路間具有密切聯系。有研究 ［16］結果顯示：破壞FAK信號通路會抑制OSX轉錄活性和hMSC成骨分化。證實了FAK是成骨細胞分化的力傳導通路中的關鍵因素。①miRA－138。Eskildsen等 ［17］篩查了成骨細胞分化期間人類BMMSCs中表達有差異的miRNAs，并認定miR－138是成骨性分化過程的潛在抑制劑。通過PicTar軟件預測并證實了miR－138潛在靶作用位點為編碼FAK蛋白的蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase　2，PTK2）。FAK 和PTK2能夠激活ERK1／2信號通路，從而使Runx2磷酸化及OSX上調使BMMSCs向成骨方向分化。利用antimiR －138抑制miR－138對FAK信號通路的活化過程，結果體內異位成骨增多且體外成骨分化明顯增強；反之，miR－138過表達能抑制骨形成。表明miR－138能通過抑制FAK及其下游信號來抑制骨的形成過程。②miRNA－31。目前對于miRNA－31在BMMSCs向成骨細胞系分化過程中發揮的功能尚存爭議。Gao等 ［18］采用微陣列芯片技術，發現miR－31在體外成骨分化過程中表達下調，并通過生物信息學分析證明Runx2是其作用靶點。在隨后的相似研究中，Baglìo等 ［19］通過基因芯片技術分析了BMMSCs成骨分化時的miRNA表達譜，發現miR－31表達上調并證實其靶定目標之一是骨特異性轉錄因子OSX。另一個體外研究組還提出了在miR－31、Runx2和Satb2（special AT－rich sequence－binding protein　2）間還存在反饋調節通路：在BMMSCs分化過程中Runx2介導了miR－31的表達下調，從而增加了Satb2蛋白水平并促進BMMSCs其向成骨細胞系的分化 ［20］。

3.2　調控成骨細胞功能的miRNA Dicer酶是miRNA成熟所必須的酶。為了探究miRNA對骨重塑的調控作用，普遍利用基因敲除技術使小鼠體內的Dicer酶功能缺失，再依據其表現型間接分析miRNA與成骨或破骨間的關系。Gaur等 ［21］采用Cre－loxP系統的條件性敲除技術，通過成骨細胞特異性標志物鼠Ⅰ型膠原（COL1A1）基因和骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）基因的啟動子來驅動Cre重組酶的表達，使其特異性識別LoxP重組序列從而去除靶基因片段。利用COL1A1啟動子敲除骨祖細胞中的Dicer基因，會引起小鼠胚胎晚期死亡。而靶定敲除成熟成骨細胞中表達OC啟動子的Dicer基因，可導致小鼠表現出圍產期的骨鈣化延遲現象。因此，可以說明經Dicer加工的miRNA的產物對于孕期骨骼發育以及產后骨的生長非常關鍵。①miR－2861。miR－2861是一種在小鼠原代成骨細胞中高表達的miRNA基因。當小鼠骨髓基質細胞中的miR－2861基因被沉默，就會導致BMP－2誘導的成骨細胞分化能力下降，而miR －2861的過表達則會促進成骨細胞分化。BMP信號能刺激Runx2乙?；⒁种芐murf介導的Runx2降解，而組蛋白去乙?；?（histone deacetylase　5，HDAC5）則干擾該過程使成骨分化受抑制。熒光素酶報告證實HDAC5是miR －2861的靶基因，所以抑制HDAC5的miR－2861可使乙?；腞unx2大量增加繼而促進成骨細胞分化。此外，有臨床研究 ［22］表明：人類體內的Pre－miR－2816突變會導致原發性骨質疏松癥。近期又有研究 ［23］證實：與miR－2861處于同一基因座位點的miR－3960也具有類似的調控作用，并建立了一個Runx2／miR－3960／miR－2861正反饋調控系統，促進成骨細胞的分化。這些研究都說明miRNA在骨代謝紊亂性疾病中發揮的作用。②miRNA－15b。最新研究 ［24］發現：miR－15b對成骨細胞分化具有正向調控作用。在BMP蛋白與其受體結合后，SMAD蛋白家族磷酸化從而激活Runx2和其他成骨標志性基因。Smurf1作為SMAD特異的泛素蛋白連接酶，可與轉錄因子Runx2相互作用并通過蛋白酶途徑使其降解。用miR－15b抑制劑處理成骨分化時期的hBMSCs，結果Runx2的蛋白水平下降；反之，miR－15b的過表達會顯著增加Runx2水平，降低Smurf蛋白水平。經熒光素酶報告證實，miR－15b可直接靶定Smurf的3′UTR使Smurf蛋白降解。因此，miR－15b能抑制Smurf1的降解作用從而間接保護Runx2蛋白來促進成骨細胞分化。

3.3　調控破骨細胞功能的miRNA　目前關于miRNA在破骨細胞中作用的研究相對有限，但也可通過特異敲除破骨細胞不同時期的Dicer基因來確定miRNA的功能。敲除骨祖細胞中的Dicer會使小鼠因破骨細胞數目及骨吸收減少而表現出輕微的骨硬化現象，但對成骨細胞卻無影響 ［25］。敲除成熟破骨細胞的Dicer，結果破骨細胞數量減少導致骨小梁處的骨沉積增多。由于破骨細胞的分化是經RANKL和巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）介導的，所以在敲除Dicer基因時，M－CSF受體表達的下降與破骨細胞數量減少有密切聯系 ［26］?？梢?，依賴Dicer酶成熟的miRNAs對于骨吸收的調控是必不可少的。①miR－124。在RANKL激活破骨細胞分化的過程中，活化T細胞核因子蛋白1 （NFATc1）作為主要的轉錄因子發揮了重要作用。研究 ［27］表明：miR－124通過抑制NFATc1的表達調控了小鼠骨髓巨噬細胞分化為破骨細胞的過程。通過特異性抑制miR－124結果增強了破骨細胞的分化和NFATc1的表達。同時，miR－124也影響了破骨細胞前體細胞的增殖及運動。這些研究結果不僅揭示了miR－124在破骨細胞形成中的重要作用，還闡述了NFATc1在破骨細胞形成中新的調控方式。②miR－223。Sugatani等 ［28］發現：在RAW264.7中，pre －miR－223前體的高表達能完全阻止抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色陽性的多核細胞形成，而敲除miR－223基因會使經RANKL誘導的破骨細胞樣細胞減少。在隨后的研究 ［25］中又發現：通過影響NFI－A和MCSF受體的表達，可實現miR－223對破骨細胞形成的調控。這些研究結果表明：適當的miR－223表達水平對破骨細胞的正常分化和形成具有重要作用。

4　炎癥條件下miRNA對骨重塑的間接調控作用

Toll樣受體（Toll－like receptors，TLR）是一類表達于固有免疫細胞上的識別分子，能通過與病原體相關分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）的特異結合活化細胞內信號通路激酶，促進炎癥因子的表達并產生免疫應答和炎癥反應。目前有研究 ［29］證明：miRNA可識別TLR并對TLR信號通路中的細胞因子具有負性調控作用。

4.1　miRNA－155　Ceppi等 ［30］發現：包括miR－155在內的多種miRNAs參與了細菌脂多糖（LPS）對樹突細胞（dendritic cells，DCs）刺激后產生的免疫應答。利用鎖核酸沉默技術（LNA silencing，lock nucleic acid silencing）與基因芯片相結合的方法，證實了TLR／IL－1炎癥信號通路是miRNA－155的作用靶點，且miR－155能直接調控TAK1結合蛋白2（TAK1 binging protein　2，TAB2）的水平。TAB2作為TLR通路級聯反應的信號轉導分子能夠促進依賴IL－1的TRAF6泛素化并激活p38和NFκB。在DCs成熟早期，miR－155低表達能活化p38MAPK通路從而促進IL－1β的表達，而miR－155又直接受控于IL－1β及其信號通路級聯反應；在DCs成熟晚期，miR－155高表達會抑制p38 MAPK通路，沉默IL－1和細胞細胞因子的表達 ［30］。因此在成熟DCs中，miR－155通過負反饋通路下調由微生物刺激所產生的炎癥因子。

骨形態蛋白（BMPs）能誘導異位骨形成，并受炎癥因子（如TNF）的負性調控作用。TNF－α通過NF－κB通路抑制BMP信號或通過激活應激活化蛋白激酶（SAPK）／氨基末端激酶（JNK）信號通路抑制由BMP誘導的成骨細胞活性 ［1］。有研究 ［31］表明：在BMP－2所誘導的成骨分化過程中，沉默miR－155基因能減輕由TNF－α介導的成骨抑制作用；經生物信息學分析證實miR－155的靶點是細胞信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling　1，SOCS1）的3′UTR，且TNF－α可通過JNK信號通路誘導miR－155的表達，表明TNF－α通過作用miR－155調控成骨分化的。

4.2　miR－29　巨噬細胞和NK細胞分泌的干擾素γ （interferonγ，IFN－γ）可抑制IL－1和TNF－α對破骨細胞活性的誘導，從而調控破骨細胞的分化。用細菌感染小鼠會使NK細胞中miR－29表達下調，而熒光素酶報告顯示miR－29可直接結合IFN－γ的3′UTR來抑制mRNA翻譯。因此，miR－29能通過靶定IFN－γ抑制胞內病原體所引起的炎癥反應 ［32］。盡管目前尚無研究直接驗證miR－29在炎癥條件下與骨重塑的必然聯系，但已有研究 ［33］結果表明：miR－29的表達能通過正反饋途徑來調控經典Wnt信號通路，從而促進成骨細胞分化。由此可推斷，miR－29或許在一定程度上是通過調控炎癥因子來影響成骨細胞分化的。

5　展　望

作為轉錄后調控因子，miRNA雖然在所有RNA中的比重很小，卻參與了人類體內約三分之一基因表達和轉錄的調控過程。近年來，miRNAs在基因表達調控領域里的研究已有了突破性進展，很多組織特異性的miRNAs其功能在骨和關節組織中已經被證實。盡管如此，識別miRNAs其潛在的靶點仍是需要深入研究，還有大量對骨具有重要作用的miRNAs有待發現，并需進一步明確其在骨形成、骨重塑、骨損傷修復及炎癥相關性骨疾病中發揮的作用。隨著對miRNA調控機制的不斷深入了解，應用miRNA治療炎癥性骨吸收和骨代謝紊亂疾病將會在不遠的將來成為現實。