結締組織生長因子蓋髓劑對牙髓組織形態學的影響及其意義

［文獻標志碼］A

［文章編號］1671－587Ⅹ（2015）01－0110－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150121

［收稿日期］2014－08－12

［基金項目］吉林省科技廳科技發展計劃項目資助課題（20130102096JC）；吉林省長春市科技局科技計劃項目資助課題（12SF88）

［作者簡介］李　雯（1989－），女，山西省長治市人，在讀醫學碩士，主要從事牙髓生物學方面的研究。

［通信作者］張穎麗，教授，碩士研究生導師（Tel：0431－88796017，E－mail：zhangyingli1989＠163.com）

Influence of capping agent CCN2in morphology of dental pulp tissue

LI Wen 1，YIN Shuo 2，ZHANG Juan 1，WANG He 1，GAN Kang 3，MA Shanshan 4，ZHANG Yingli　 1

（1.Department of Operative Dentistry and Endodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；2.Department of Prosthodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；3.Department of Comprehensive Treatment，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；4.Department of Implantation，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China）

Abstract：Objective To observe the histomorphological changes of dental pulp of the rats with mechanical injury at different time points after treated with connective tissue growth factor（CTGF／CCN2）and to clarify its mechanism.Methods Tweenty Wistar rats were divided into five groups，one group was randomly selected as normal group，each Wistar rat in the other four groups（groups of　3d，7d，14dand　28d）was prepared with a cavity on the occlusal surface of maxillary first molars on both sides.CCN2was applied on the left exposed pulp for the PBS experimental group，and PBS was applied on the right exposed pulp for the control group.Four rats，one in each group，were put to death respectively on the　3rd，7th，14th and　28th day after operation.The teeth of each rat were fixed，decalcified and made to sections，which were stained with HE.The histomorphological changes of dental pulp tissue in each sample were observed.Results In control group，the inflammation under the amputated site was more obvious than the experimental group at　3dand　7d；the inflammatory cells were decreased andscattered reparative dentin was observed in　14d；necrosis was observed at　28d.While in experimental group a large number of inflammatory cells gathered under the amputated site at　3d，as well as the dilatation of blood vessels was observed；7dafter injury the inflammation in experimental group was reduced.Compared with control group，the leukomonocytes were less.After injury for　14dthe calcified bridge was observed and the inflammatory cells disappeared；28 d after injury the reparative dentin was observed.Conclusion CCN2 participates in the reconstruction of the tissue structure after dental pulp injury.It indicates that CCN2is a good pulp capping agent.Keywords：connective growth factor；dental pulp；dental pulp capping；reconstruction

牙髓組織是疏松的結締組織，是牙體組織中唯一的軟組織，具有形成牙本質、營養、感覺和防御功能及修復再生能力 ［1］。當遇到感染和組織損傷等外源性刺激時，牙髓可產生由各種細胞因子介導一系列級聯反應。牙髓損傷后的修復是一個很復雜的過程，通常認為成纖維細胞、中性粒細胞和牙髓干細胞的遷移、血管再生以及修復性牙本質的形成是牙髓組織在修復過程中的基本特征 ［2］?；钏柚委熞恢北徽J為是牙髓生物學中最可靠的治療方法。如何促進牙髓組織結構的重建和形成牙體硬組織是目前研究的焦點。最近研究 ［3－5］顯示：CCN蛋白由一組具有高度序列同源性的多肽因子組成，在胚胎發育、炎癥反應、損傷修復、纖維性疾病和腫瘤的發生中起重要作用。而結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF／CCN2）是CCN家族的重要成員，早期國內學者發現CCN2在腫瘤細胞中過度表達時腫瘤細胞轉移浸潤的能力更強。Muromachi等 ［6］體外研究證實：CCN2在基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinases－3，MMP－3）的誘導下可以促進牙髓細胞的增殖、遷移和血管的再生。隨后又有學者 ［7］發現：CCN2可以促進軟骨細胞、成骨細胞和血管內皮細胞增殖、遷移及血管形成。本研究將CCN2用于大鼠牙髓損傷創面，觀察牙髓損傷修復過程中組織的形態學變化，為臨床開發新的蓋髓劑提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　實驗動物、主要試劑和儀器　清潔級8周齡雄性Wistar大鼠20只，體質量180～220g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（吉）2013－0001。3%水合氯醛、乙醚均購自長春市永輝化工商貿有限公司；膠原蛋白海綿，由吉林大學口腔頜面外科提供；100g·L －1EDTA溶液、4%多聚甲醛和3%生理鹽水均購自北京恒業中遠化工有限公司；CCN2購自美國Sigma公司。1／4鎢鋼球鉆和高速渦輪機購自上海醫用儀器設備廠；雙目光學顯微鏡（BD－45B2）購自德國UBM生物技術公司；開口器為自制。

1.2　動物標本的制備　將20只Wistar大鼠稱體質量，適應性飼養1周后，平均分為5組，隨機取一組為正常組，其余4組分別為3、7、14和28d組。除正常組外，每組大鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢成仰臥位。2%碘伏溶液消毒口腔，雙側上頜第一磨牙用1／4球鉆在頜面中央制洞，見穿髓孔時停止操作，生理鹽水沖洗。無菌棉球干燥牙面，在左側上頜第一磨牙露髓處放含有CCN2（100g·L －1）的膠原蛋白海綿作為實驗組，在右側上頜第一磨牙露髓處放含有PBS緩沖液的膠原蛋白海綿作為對照組，用富士Ⅸ玻璃離子充填窩洞。各組大鼠分別于3、7、14和28d心臟灌流處死，待組織變硬立即斷頭取上頜牙齒標本，并置于4%多聚甲醛中常溫固定48 h后，再置于100g·L －1　EDTA溶液中脫鈣10周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規石蠟包埋。將標本連續切片，片厚5μm。

1.3　HE染色方法　將切片放入60℃的烘片機中過夜將蠟烤化，次日取出依次放入脫蠟二甲苯（Ⅰ）中10min，脫蠟二甲苯（Ⅱ）中10min，再放入無水酒精（Ⅰ）中5 min，無水酒精（Ⅱ）中5 min，90%、85%和80%酒精各1～3min，然后流水沖洗5min左右，觀察切片直至清亮，不成云霧狀即可。沖洗后放入蘇木精中染色6min左右，再移入流水沖洗，去掉大部分浮色后再放入1%鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗。氨水（pH＝8.0）浸泡約數秒，流水沖洗。再放入0.5%伊紅溶液中浸染5min。然后依次80%、85%、90%和95%酒精各1～2min，然后分別放入無水酒精（Ⅰ）和無水酒精（Ⅱ）5min，最后二甲苯透明5～10min，用中性樹膠封片。

1.4　大鼠牙髓組織形態學觀察　光鏡下觀察對照組和實驗組大鼠上頜第一磨牙的炎癥反應情況和修復性牙本質形成情況。

2　結果

2.1　正常組大鼠牙髓形態學　光鏡下觀察，正常組大鼠牙髓組織分為成牙本質細胞層、乏細胞層、多細胞層和固有層。外層成牙本質細胞呈柵欄狀排列緊密、整齊，內側成纖維細胞呈星形，間質可見少量血管和纖維組織。見圖1（插頁三）。

2.2　對照組大鼠牙髓形態學　光鏡下觀察，對照組中3d組大鼠在露髓點下方可見大量炎細胞浸潤，炎癥較實驗組明顯，血管擴張，前期牙本質無明顯變化（圖2A，見插頁三）；7d組炎癥細胞向正常牙髓內浸潤，數量較相對應的實驗組多，成纖維細胞與牙本質之間有少量的前期牙本質形成，無骨樣牙本質及修復性牙本質生成（圖2B，見插頁三）；14d組仍存在一定范圍的炎細胞浸潤，但前期牙本質不均勻增厚，可見散在修復性牙本質（圖2C，見插頁三）；28d組可見髓室內牙髓有變性壞死征兆，但仍可見增厚的前期牙本質形成了一定量的修復性牙本質（圖2D，見插頁三）。

2.3　實驗組大鼠牙髓形態學　光鏡下觀察，實驗組中3d組大鼠在露髓點下方可見大量炎細胞聚集，成牙本質細胞排列緊密，可見明顯的血管擴張及新生血管（圖3A，見插頁三）；7d組炎癥減輕，大量的成牙本質細胞樣細胞聚集，可見成纖維細胞與牙本質之間形成少量前期牙本質（圖3B，見插頁三）；14d組形成連續完整的鈣化橋，成牙本質細胞樣細胞增生活躍，排列紊亂，無明顯炎細胞浸潤（圖3C，見插頁三）；28d組在髓室內已形成非常厚的修復性牙本質，成牙本質細胞排列正常，牙髓組織內無明顯炎細胞浸潤（圖3D，見插頁三）。

3　討論

牙本質構成牙體硬組織的主體，而牙髓組織則包含于中央的髓腔中，主要由牙髓成纖維細胞、成牙本質細胞、未分化間充質細胞和防御細胞組成 ［8］。成牙本質細胞排列在髓腔最外層，當牙髓組織受到外界輕微刺激時，成牙本質細胞分泌基質形成前期牙本質，并與牙髓形成牙髓－牙本質復合體保護牙髓不受損傷。當牙髓受到較強烈的刺激如感染或外傷導致暴露時，其儲備的未分化間充質干細胞遷移至損傷處增殖，分化為成牙本質細胞樣細胞，分泌牙本質基質，最終形成修復性牙本質，這是牙髓自身修復的潛能，也是活髓保存治療的生物學基礎 ［9］。從傳統的氫氧化鈣蓋髓劑到現在新興的三氧化礦物凝聚體（MTA） ［10］蓋髓劑對牙髓損傷后組織的改建起到了一定的作用。但是氫氧化鈣中高鈣離子濃度常常使牙髓組織凝固性壞死，而MTA價格昂貴，不宜用于基礎研究。許多學者研究 ［11－13］發現：CCN家族的成員之一CCN2一直是近幾年來研究的熱點，其廣泛存在于人類各結締組織，主要由成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、神經細胞和癌細胞等分泌合成。在胚胎發育與分化，血管形成與再生，傷口修復，纖維性病變，炎性病變，腫瘤的發生發展，骨的形成與修復等多種生物學過程中起重要的作用。早期研究 ［14－15］顯示：CCN2主要在軟骨細胞、成骨細胞和血管內皮細胞中可檢測到，可促進軟骨細胞的分化和細胞外基質的形成。所以本研究中擬設定CCN2對牙髓組織損傷后的改建會有一定的促進作用，并將CCN2用作蓋髓劑，觀察牙髓組織在修復過程中的形態學變化。

本研究結果顯示：實驗組中3d組和對照組大鼠牙髓均出現明顯的炎癥反應，細胞胞體固縮、扁平，血管擴張。這就在一定程度上說明了早期階段的炎癥反應是牙髓修復過程中關鍵的一部分 ［16］。隨著免疫防御系統的免疫應答作用增強，本研究中實驗組7d時炎癥逐漸減輕，炎細胞以淋巴細胞為主。成牙本質細胞在髓腔內細胞因子的刺激下分泌活動加劇，在損傷的早期階段分泌細胞外基質形成病理性沉積，即前期牙本質。由于受到強烈的外傷刺激，原代成牙本質細胞合成分泌基質的同時很快凋亡，此時牙髓組織內具有分化潛能的牙髓間充質干細胞將移行到該處，并分化為成牙本質細胞樣細胞取代死亡的細胞 ［17］，然后繼續合成分泌基質形成骨樣牙本質；14d時中前期牙本質逐漸增厚形成有管狀結構的連續的鈣化橋，而對照組由于缺少蓋髓劑仍存在一定范圍內的炎癥；28d時穿髓孔的下方的成牙本質細胞樣細胞分化越來越完善，最終獲得細胞突。這就使得其分泌的膠原在骨樣牙本質周圍逐漸沉積形成具有管狀結構的修復性牙本質。本研究結果同時顯示：對照組28d時可以看到露髓處下方有明顯的壞死病灶，但由于牙髓－牙本質復合體對外界刺激的防御性反應，仍形成了一定范圍的反應性牙本質。

綜上所述，牙髓損傷后組織的改建過程是一個很復雜的生物學過程，可以概括為以下幾個方面 ［18］：初期階段必不可少的炎癥反應如炎細胞大量聚集，血管擴張以及新生血管的形成等；成牙本質細胞分泌活動的增強和凋亡；牙髓間充質干細胞在損傷部位增殖并分化為成牙本質細胞樣細胞；成牙本質細胞樣細胞向外分泌基質形成修復性牙本質。同時本研究結果表明：CCN2蓋髓劑對牙髓損傷后組織的改建有一定的促進作用，是一種良好的蓋髓劑，但其作用機制需要進一步研究。