藍莓酒渣花色苷的超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性

劉晨　劉安軍　馬艷弘　等

摘要：研究藍莓酒渣中花色苷的超聲波輔助提取工藝及花色苷的抗氧化活性，在單因素試驗基礎上，通過響應面分析法優化超聲波輔助提取工藝，建立了花色苷提取的二次項數學模型，測定了其抗DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力。結果表明：藍莓酒渣花色苷的最佳提取條件為超聲時間50 min、液料比33 mL ∶1 g、提取溫度 65 ℃，在此條件下，藍莓酒渣花色苷的提取率為6.092 mg/g，所提酒渣花色苷具有較好的抗氧化活性，0.16 mg/mL花色苷提取液對DPPH自由基的清除率達81.7%，抗超氧陰離子自由基能力達220.89 U/L，對羥自由基的抑制率為82.40%。

關鍵詞：藍莓酒渣；花色苷；超聲波輔助；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號： Q946.91+9；O657.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0242-05

收稿日期：2014-08-29

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2012786）；南京市生物農業項目。

作者簡介：劉晨（1990—），女，山東樂陵人，碩士研究生，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail：jgee39@sina.com。

通信作者：馬艷弘，博士，副研究員，主要從事發酵食品與副產物綜合利用研究。Tel：（025）84391287；E-mail：ma_yhhyy@126.com。藍莓為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium spp.）植物，是21世紀的功能性保健漿果，被聯合國糧農組織（FAO）列為人類五大健康食品之一，富含花青素、黃烷醇、酚酸等多種活性物質[1-3]，有抗氧化、抗炎、抗癌、護肝、抗衰老、軟化血管、保護視力、增強人機體免疫力等多種藥理保健功效[4-8]，具有極高的經濟價值和開發前景。藍毒花青素（anthocyanins）是藍莓藥理活性的主要物質基礎，屬黃酮類化合物，常以半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、蕓香糖苷等花色苷形式存在[9-10]。

隨著消費者對藍莓營養保健功能認識的增強，藍莓汁、藍莓醬、藍莓酒等相關產品風靡世界，其中藍莓酒由于具有營養豐富、酒體醇厚、色澤艷麗、口味綿長、香氣宜人等特點而備受消費者推崇。但是在藍莓酒釀造過程中產生的大量酒渣卻并未得到充分利用，而研究認為，藍莓酒渣中仍含有大量花色苷，利用合理的方法提取藍莓酒渣中的花色苷、提高藍莓酒渣資源的綜合利用率是當前加速藍莓產業發展的重要途徑之一。

國內外許多學者對花色苷的提取方法做了大量研究，采用的方法主要有溶劑萃取法、酶法輔助法、微波輔助法等[11-13]。借助超聲波進行輔助提取是近年來色素提取研究中發展的新技術，這種方法可有效破碎植物細胞壁，具有色素溶出快、提取時間短、萃取效率高等優點[14-19]。眾多的研究主要集中在藍莓果實中花色苷的分離提取，而對于藍莓酒渣中花色苷的高效提取技術還鮮見報道，因此本試驗利用超聲波輔助提取法，通過響應面分析法對提取條件進行優化，并探討其抗氧化活性，以期為提高藍莓酒渣綜合利用率提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藍莓酒渣，由江蘇省句容市萬山紅遍生物科技有限公司提供；25%藍莓花色苷標準品，陜西森弗天然制品有限公司；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純試劑。

1.2儀器設備

DHG-9070電熱鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器，常州國華儀器有限公司；KH-500E超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；D-B分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-5220型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；ZD-F12真空冷凍干燥機，南京載智自動化設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1藍莓酒渣花色苷超聲提取工藝將藍莓酒渣平鋪于鼓風干燥箱內，于45 ℃烘干至恒重，用高速粉碎機粉碎后過80目篩。取干粉按一定比例加入檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3），浸泡10 min后置于超聲波清洗器中進行不同時間的超聲處理。然后置于不同溫度磁力攪拌器中避光提取1 h，抽濾，回收濾渣，加入同體積提取液，在相同溫度下再提取1次，合并2次上清液，50 ℃旋轉蒸發后，選用AB-8大孔樹脂進行純化[20]，流速2 mL/min，待回收液吸光度值達上樣提取液吸光度值10%時停止上樣。用蒸餾水洗去樹脂未吸附雜質，并采用考馬斯法和硫酸苯酚法分別測定回收液中蛋白質含量和還原糖含量，當二者無檢出時，用檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3）進行洗脫。收集洗脫液于50 ℃旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥，真空包裝后于4 ℃避光貯藏備用。

1.3.2藍莓酒渣花色苷提取率的測定采用pH示差法[21]測定花色苷含量。準確吸取1mL待測提取液于具塞試管中，再分別加入4 mL pH值為1.0、4.5的緩沖液，避光條件下放置60 min達平衡，利用分光光度計分別測量520、700 nm處的吸光度值。

提取液花色苷含量計算公式：

C=ΔD×M×n×Vε×1×m×1 000；

ΔD=[（D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0）-（D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）]

式中：C為花色苷含量，mg/g；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數，26 900；m為樣品質量，g；l為光程，1 cm。

實際測定后，將計算結果換算為1 g藍莓酒渣中含有花色苷的質量（mg）。

1.3.3單因素試驗設計以藍莓酒渣花色苷提取率為考察目標，以檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3）為提取液，在超聲功率500 W的條件下，考察不同超聲時間、液料比、提取時間對花色苷提取率的影響，提取條件的單因素設計見表1。 表1藍莓酒渣花色苷提取單因素試驗設計

因素水平其他提取條件超聲時間10、20、30、40、50、60 min液料比20 mL ∶1 g，提取溫度50 ℃，提取1 h，提取2次液料比

5 mL ∶1 g、10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g超聲時間30 min，提取溫度50 ℃，提取1 h，提取2次

提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃超聲時間30 min，液料比20 mL ∶1 g，提取1 h，提取2次

以上試驗均進行2次平行試驗，結果取平均值。

1.3.4Box-Behnken試驗設計及響應面分析根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計方案，以超聲時間A、液料比B、提取溫度C為考察因素，以花色苷提取率為響應值，利用Design-Expert8.0.5b軟件優化藍莓酒渣花色苷提取工藝。試驗因素水平編碼見表2。

表2Box-Behnken試驗因素水平編碼

水平因素因素A：超聲時間

（min）B：液料比

（mL ∶g）C：提取溫度

（℃）-14020 ∶15005030 ∶16016040 ∶170

1.3.5藍莓酒渣花色苷抗氧化活性檢測[22-23]

1.3.5.1DPPH自由基清除能力測定配置0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL的藍莓酒渣花色苷溶液，各取2 mL于具塞試管中，每管加入2 mL 2×10-4 mol/L DPPH溶液，搖勻后避光放置30 min。以同濃度維生素C和25%藍莓花色苷標準品為陽性對照，分別測定517 nm處的吸光度D517 nm。

DPPH·清除率=[1-（D517 nm（i）-D517 nm（j））/D517 nm（o）]×100%。

式中：D517 nm（i）、D517 nm（j）、D517 nm（o）分別為測定條件為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液、2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇、2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.5.2抗超氧陰離子自由基能力測定配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液，按試劑盒說明書操作，取同濃度維生素C溶液和25%藍莓花色苷標準品溶液作對照，無水乙醇作空白對照。超氧陰離子自由基清除能力計算公式如下：

抗超氧陰離子活力單位（U/L）=（D550 nm（對照組）-D550 nm（試驗組））/（D550 nm（對照組）-D550 nm（標準組））×標準品濃度（mg/mL）×1 000 mL。

1.3.5.3清除羥自由基能力的測定分別取0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL樣品溶液，按試劑盒說明書操作，其呈色與OH·的多少成正比關系，即吸光度越小，樣品對羥自由基的清除能力越強。取同濃度維生素C溶液和25%藍莓花青素標品溶液作陽性對照，以無水乙醇作空白對照。羥自由基抑制能力計算公式如下：

抑制率=（D對照組-D試驗組）/D對照組×100%。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1超聲時間對藍莓酒渣花色苷提取率的影響如圖1所示，隨超聲時間的延長，藍莓酒渣花色苷提取率逐漸增大，當提取時間超過50 min以后，提取率基本趨于穩定。這可能是因為當時間達50 min時，在超聲作用下酒渣基本完全破壁，繼續延長超聲時間反而會使部分花色苷分解，因此，50 min 為適宜的超聲時間。

2.1.2液料比對藍莓酒渣花色苷提取率的影響如圖2 所示，在液料比30 mL ∶1 g以內，隨液料比逐漸增大，花色苷提取率逐漸增加；當液料比達30 mL ∶1 g后，繼續增大提取溶劑量，提取率增加極其緩慢。結果說明，增加溶劑量會增大花色苷擴散速度，使提取速度加快，但過量的提取溶劑會導致物料吸收的超聲能減少、花色苷溶出不充分，而且過高溶劑量既增加了成本，又加重了后續濃縮負擔，因此綜合考慮可以確定 30 mL ∶1 g 為最佳液料比。

2.1.3提取溫度對藍莓酒渣花色苷提取率的影響如圖3所示，提取溫度低于60 ℃時，隨著提取溫度的增加，花色苷的提取率逐漸增大；60～70 ℃之間，花色苷提取率相對平穩；超過70 ℃后，花色苷提取率反而下降。這是因為花色苷的溶解度會隨溫度升高而提高，但溫度過高會使少部分花色苷結構發生變化，使得提取率下降，因此綜合比較可選60 ℃為藍莓酒渣花色苷適宜的提取溫度。

2.2響應面試驗設計與結果

2.2.1回歸模型建立及方差分析采用Box-Behnken設計方案，以提取率為響應值，優化藍莓酒渣花色苷提取工藝。試驗設計與結果見表3，其中實測值為3次平行試驗結果的平均值。

應用Design Expert8.0.5b軟件對試驗結果進行多元回歸

表3響應面試驗設計及結果

序號A：超聲時

間（min）B：液料比

（mL ∶g）C：提取溫

度（℃）提取率（mg/g）實測值預測值10-115.8355.85201-15.9835.973-10-15.7955.84-1105.9325.9551016.1026.106-1015.9375.947-1-105.6545.6481-105.9235.9190006.0216.01100006.0326.01110005.9846.01120116.0756.061310-16.0186.02141106.0566.07150-1-15.7125.72

分析，得到以藍莓酒渣花色苷提取率為響應值的回歸方程為：

花色苷提取率（mg/g）=2.017 42+0.053 071A+0085 525B+0.037 237C-3.62 500×10-4AC-1.450 00×10-4AC-7.750 00×10-5BC-2.966 67×10-4A2-9.141 67×10-4B2-1.966 67×10-4C2。

式中：A為超聲時間，min；B為液料比，mL ∶g；C為提取溫度， ℃。

對模型進行顯著性分析，由表4可知，回歸模型極顯著（P=0.000 2<0.01），失擬項（P=0.645 7）不顯著，實際試驗值與預測值具有高度相關性（R2=0.989 8，R2Adj=0.971 5），表明模型與試驗值擬合良好[24]，試驗方法可信度高，試驗得到的2次回歸方程能夠很好地對響應值進行預測。由表4還可知，3個自變量對響應值的影響程度大小依次為液料比（B）>超聲時間（A）>提取溫度（C），其中3個因素以及液料比的 2次項（B2）對花色苷提取量影響極顯著（P<0.01），超聲時間和料液比的交互作用（AB）對花色苷提取量影響顯著（P<0.05）。表4方差分析結果

參數平方和自由度均方F值P值顯著性模型0.246 366 01790.027 374 00254.036 522 820.000 2極顯著A：超聲時間0.076 245 12510.076 245 125150.508 554<0.000 1極顯著B：液料比0.106 260 510.106 260 5209.759 170 9<0.000 1極顯著C：提取溫度0.024 310 12510.024 310 12547.988 402 70.001 0極顯著AB0.005 256 2510.005 256 2510.375 8841 90.023 4顯著AC0.000 84110.000 8411.660 141 4710.254 0BC0.000 240 2510.000 240 250.474 255 6340.521 7A20.003 249 64110.003 249 6416.414 820 2510.052 4B20.030 856 64110.030 856 64160.911 283 490.000 6極顯著C20.001 428 10310.001 428 1032.8190871470.154 0殘差0.002 532 91750.000 506 583失擬項0.001 268 2530.000 422 750.668 555 6140.645 7不顯著純誤差0.001 264 66720.000 632 333總和0.248 898 93314R20.989 8R2Adj0.971 5

2.2.2響應面圖分析與優化圖4至圖6反映了幾個因素間的交互作用對藍莓酒渣花色苷提取率的影響。響應曲面圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對提取率的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較??；等高線圖反映了因素間交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[24]。由圖4可見，超聲時間與液料比交互作用的響應面坡度陡，等高線密集，說明二者交互作用顯著；同一超聲時間下，隨液料比增加，提取率顯著增加；與之相比，在同一液料比水平下，隨著超聲時間的增加，提取率增加幅度較緩。由圖5、圖6看出，2個因素間交互作用的響應面坡度緩，等高線稀疏，說明二者交互作用不顯著，這一結論與方差分析中3個自變量F值大小排序所反映的趨勢一致。

2.2.3最優提取工藝條件及驗證試驗通過軟件分析得到藍莓酒渣花色苷超聲輔助法最佳提取工藝為：超聲時間4996 min、液料比33.48 mL ∶1 g、提取溫度65.15 ℃，在此條件下，藍莓酒渣花色苷提取率可達6.110 95 mg/g。為了操作方便，修正最佳提取工藝條件為：超聲時間50 min、液料比 33 mL ∶1 g、提取溫度65 ℃。在此條件下，進行3次平行試驗，所得提取率平均值為6.092 mg/g，實測值與預測值相對誤差僅為0.31%，說明該優化設計方案可以較好地預測藍莓酒渣花色苷提取情況。

2.3藍莓酒渣花色苷抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除能力如圖7所示，隨著溶液濃度的增加，3種樣品清除DPPH自由基能力不斷增強，同濃度條件下，維生素C清除DPPH自由基能力高于25%藍莓花色苷標準品和藍莓酒渣花色苷。當藍莓花色苷標準品溶液和藍莓酒渣花色苷溶液濃度為0.01～0.02 mg/mL時，前者對DPPH

自由基的清除率高于后者；隨濃度逐漸增大并大于 0.04 mg/mL 后，前者的清除率低于后者；當藍莓酒渣花色苷溶液濃度達0.08mg/mL時，清除率達78.59%；濃度達 0.16 mg/mL 時，清除率達81.70%。

2.3.2抗超氧陰離子自由基能力由圖8可見，隨著溶液濃度的增加，3種樣品抗超氧陰離子自由基能力不斷增強；相同濃度條件下，維生素C抗自由基能力高于25%藍莓花色苷標準品和藍莓酒渣花色苷。25%藍莓花色苷標準品抗自由基能力在一定濃度內略高于藍莓酒渣花色苷，當藍莓酒渣花色苷溶液濃度達0.16 mg/mL時，抗自由基能力達220.89 U/L。

2.3.3羥自由基抑制能力如圖9所示，隨著3種樣品溶液濃度增加，羥自由基抑制率不斷提高。同濃度時抗維生素C對羥自由基的抑制能力大于25%藍莓花色苷標準品、藍莓酒渣花色苷。當藍莓花色苷標準品溶液和藍莓酒渣花色苷溶液濃度為0.01～0.02 mg/mL時，前者自由基抑制率低于后者；隨濃度增大為0.04～0.16 mg/mL時，后者自由基清除率低于前者；當藍莓酒渣花色苷濃度達0.08 mg/mL時，羥自由基清除率達66.54%；濃度達0.16 mg/mL時，羥自由基清除率達82.40%。

綜合分析以上3組試驗結果可知，藍莓酒渣花色苷具有較好抗氧化能力，與25%藍莓花色素苷標準品抗氧化能力接近。

3結論

在單因素試驗基礎上，通過響應面分析法優化了藍莓酒渣花色苷最佳提取工藝，建立了可靠的預測模型，得到藍莓酒渣花色苷最優提取條件為：檸檬酸酸化70%乙醇（體積含量，pH值=3）為提取液，浸泡10 min，液料比33 mL ∶1 g、超聲時間50 min、提取溫度65 ℃、連續提取2次。此條件下藍莓酒渣花色苷提取率為6.092 mg/g，與理論預測值基本一致。通過DPPH自由基清除能力、抗超氧自由基能力、羥自由基抑制能力測試發現，所提酒渣花色苷具有較強的抗氧化活性，0.16 mg/mL 的花色苷提取液對DPPH自由基清除率達8170%，抗超氧陰離子自由基能力達220.89 U/L，羥自由基抑制率為82.40%。由此可見，超聲輔助提取的藍莓酒渣花色苷得率較高、抗氧化能力較強，既為節能環保、提高藍莓酒渣資源的利用率提供了很好的思路，又為藍莓酒渣花色苷工業化生產提供了試驗依據。

參考文獻：

[1]方仲相，胡君艷，江波，等. 藍莓研究進展[J]. 浙江農林大學學報，2013，30（4）：599-606.

[2]胡雅馨，李京，惠伯棣. 藍莓果實中主要營養及花青素成分的研究[J]. 食品科學，2006，27（10）：600-603.

[3]Kong J M，Chia L S，Goh N K，et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry，2003，64（5）：923-933.

[4]Wang Li Shu，Stoner G D. Anthocyanins and their role in cancer prevention[J]. Cancer Letters，2008，269（2，SI）：281-290.

[5]Wang S Y，Chen H J，Ehlenfeldt M K. Variation in antioxidant enzyme activities and nonenzyme components among cultivars of rabbiteye blueberries （Vaccinium ashei Reade） and V. ashei derivatives[J]. Food Chemistry，2011，129（1）：13-20.

[6]Lacombe A，Wu V C，White J，et al. The antimicrobial properties of the lowbush blueberry （Vaccinium angustifolium） fractional components against foodborne pathogens and the conservation of probiotic Lactobacillus rhamnosus[J]. Food Microbiology，2012，30（1）：124-131.

[7]Prior R L，Wilkes S E，Rogers T R，et al. Purified blueberry anthocyanins and blueberry juice alter development of obesity in mice fed an obesogenic high-fat diet[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（7）：3970-3976.

[8]Yi W G，Akoh C C，Fischer J，et al. Effects of phenolic compounds in blueberries and muscadine grapes on HepG2 cell viability and apoptosis[J]. Food Research International，2006，39（5）：628-638.

[9]李穎暢，馬勇，孟憲軍，等. 圣云藍莓花色苷的組成分析[J]. 食品與發酵工業，2009，35（8）：129-132.

[10]Kalea A Z，Lamari F N，Theocharis A D，et al. Wild blueberry （Vaccinium angustifolium） consumption affects the composition and structure of glycosaminoglycans in Sprague-Dawley rat aorta[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry，2006，17（2）：109-116.

[11]高梓淳，吳濤，陳衛，等. 藍莓花色苷提取與純化工藝的研究[J]. 食品與發酵科技，2013，49（3）：1-5，18.

[12]袁春龍，張金. 纖維素酶和果膠酶對番茄紅素提取的影響[J]. 食品科學，2010，31（13）：100-104.

[13]呂春茂，王新現，董文軒，等. 響應面法優化越橘花色苷微波輔助提取工藝參數[J]. 食品科學，2011，32（6）：71-75.

[14]慕金超，劉春芬. 紫茄皮中花青素的提取研究[J]. 江蘇農業科學，2014，42（4）：227-229.

[15]姬曉靈，屈愛桃，汪嶺，等. 超聲波輔助提取百脈根花色素工藝[J]. 江蘇農業科學，2013，41（11）：298-301.

[16]肖軍霞，黃國清，遲玉森. 櫻桃花色苷的提取及抗氧化活性研究[J]. 中國食品學報，2011，11（5）：70-75.

[17]Corrales M，Toepfl S，Butz P，et al. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics，high hydrostatic pressure or pulsed electric fields：A comparison[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies，2008，9（1）：85-91.

[18]遲海霞，涂宗財，陳鋼，等. 米糠多糖的超聲波輔助纖維素酶-檸檬酸聯合提取及結構分析[J]. 食品科學，2010，31（24）：168-171.

[19]焦巖，王振宇. 藍靛果花色苷超聲波輔助提取優化及其降血脂作用[J]. 中國食品學報，2010，10（2）：52-59.

[20]李穎暢，鄭鳳娥，孟憲軍. 大孔樹脂純化藍莓果中花色苷的研究[J]. 食品與生物技術學報，2009，28（4）：496-500.

[21]宋德群，孟憲軍，王晨陽，等. 藍莓花色苷的pH示差法測定[J]. 沈陽農業大學學報，2013，44（2）：231-233.

[22]牟建樓，王頡. 響應面法優化靈芝棗飲料工藝及其抗氧化性研究[J]. 中國食品學報，2013，13（11）：21-27.

[23]Li X X，Han L J，Chen L J. In vitro antioxidant activity of protein hydrolysates prepared from corn gluten meal[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88（9）：1660-1666.

[24]程丹，傅玉穎，梅子，等. 響應曲面法優化酵母微膠囊化核桃油工藝[J]. 中國食品學報，2013，13（11）：28-34.江寧，李麗娟，李大婧，等. 蓮藕片熱風干燥特性及動力學模型[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：247-250.