枯草芽孢桿菌對板栗采后黑斑病的抑制效果

陳忠杰　胡燕

摘要：將從發酵豆制品中分離出的枯草芽孢桿菌作為生防菌株，研究了該菌的菌懸液和培養液濾液對板栗采后黑斑病的抑制效果。結果表明，枯草芽孢桿菌菌懸液可以使板栗采后黑斑病的發病率降低約75百分點，其濾液也可以使板栗采后黑斑病的發病率降低約45百分點。這說明枯草芽孢桿菌可以顯著降低板栗采后黑斑病的發病率，并且枯草芽孢桿菌的抑菌作用是通過菌體和代謝物質共同實現的，其代謝產物的抑菌效果比菌體強，起主要的抑菌作用?？莶菅挎邨U菌可以作為一種新型的保鮮劑應用于板栗保鮮，對于減少板栗腐爛率、延長貯藏期、增加經濟效益具有重要意義。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；板栗；黑斑??；生物防治

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0256-03

收稿日期：2014-02-21

作者簡介：陳忠杰（1978—），男，河南商丘人，碩士，講師，主要從事微生物資源的開發及利用研究。E-mail：chzhji@126.com。板栗原產我國，是我國特色堅果之一，因其營養豐富，味道甘美，且有補腎益氣、養胃健脾、活血止血、延緩人體衰老的功效而素有“干果之王”的美稱[1]。新鮮板栗含水量高，而且采后呼吸旺盛，在貯藏期間還易受到微生物的侵襲而產生霉變，因此板栗很不耐貯藏。中國板栗每年因貯藏不當或栗實霉爛而造成的損失可達板栗年總產量的1/4左右[2]。板栗黑斑病的發生是造成板栗霉爛的重要原因之一。關于板栗的貯藏保鮮方法目前已有較多研究，主要有冷藏[3]、化學防腐劑處理[4-5]、熱處理[6]、涂膜[7-8]等。這些方法在一定程度上確實能夠延長板栗的貯藏期，減少因為霉爛而造成的經濟損失，但是這些方法也有不足之處，如冷藏耗能高、成本高，熱處理可能對板栗的質構和風味有一定影響，涂膜和化學防腐劑的使用有可能造成一定程度的食品安全隱患。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力[9]?？莶菅挎邨U菌用于防治植物病害的作用已受到國內外的廣泛認可，國內外均已有多個以枯草芽孢桿菌開發的生物農藥上市銷售并推廣到農業生產中?？莶菅挎邨U菌應用于植物病害生物防治的研究已經有很多年的歷史，目前在黃瓜、辣椒、水稻、小麥、玉米等農作物病害上顯出較好的防治效果[10]。但用枯草芽孢桿菌防治板栗黑斑病的研究還較少。本試驗以采后的新鮮板栗為原料，研究了枯草芽孢桿菌對采后板栗黑斑病的抑制效果，以期為板栗的貯藏保鮮找到一個成本低、效果好并且安全環保的新方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

枯草芽孢桿菌菌種由筆者所在實驗室從發酵豆制品中分離和保存；板栗，產地河南信陽，購于鄭州市陳寨農產品批發市場；蛋白胨，鄭州亞世生物技術有限公司生產；瓊脂，鄭州亞世生物技術有限公司生產；酵母浸膏，宜興市江山生物制劑有限公司生產；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器與設備

LHS-100CH型恒溫恒濕培養箱，上海一恒儀器有限公司生產；SHY-3 型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠生產；722型分光光度計，上海光譜儀器有限公司生產；YX280AS手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫療器械有限公司生產；其他玻璃儀器均為河南銘駿儀器儀表有限公司生產。

1.3試驗方法

1.3.1枯草芽孢桿菌菌種活化分別稱取蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，NaCl 10.0 g，1 L蒸餾水，再調pH值至弱堿性，121 ℃濕熱滅菌20 min，配制好的LB液體培養基備用。用接種環挑取保存于固體斜面培養基上的枯草芽孢桿菌菌落1～2環，接種到配制好的LB液體培養基100 mL中，在37 ℃左右的溫度下振蕩培養24 h，得到活化菌懸液，備用。

1.3.2枯草芽孢桿菌生長曲線的測定[11]分別準確吸取 1.0 mL 活化菌懸液（1×107 CFU/mL）于已裝50 mL LB液體培養基的250 mL錐形瓶中，在轉速150 r/min、37 ℃下恒溫振蕩培養。每隔12 h取出2.0 mL培養液于試管中，以不含菌LB液體培養基調零管，測定不同培養時間下570 nm處吸光度（D570 nm）。濃度大的發酵液用LB液體培養基稀釋適當倍數，使吸光度在0.10～1.00之間，將稀釋液對應的吸光度乘以相應稀釋倍數，換算成原發酵液吸光度，以培養時間為橫坐標，570 nm處吸光度為縱坐標，繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線。

1.3.3病原菌的分離稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1 L，加瓊脂15 g，煮沸0.5 h，紗布過濾，再加10～20 g 葡萄糖，充分溶解后定容到1 L，121 ℃滅菌30 min，配制好PDA培養基備用。選擇已產生嚴重斑點的黑斑病板栗病果為材料，將黑斑病板栗用小刀切成碎末，稱取帶菌板栗碎末5 g于30 mL無菌水中，混合振蕩2 min，取一定稀釋度的水洗液接種于已倒好PDA培養基的培養皿中，于28 ℃左右的溫度培養5 d。再通過平板劃線技術完成不同病菌種類的分離。將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無菌水溶液配制成濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液，最后再等體積混合各種病原菌孢子懸浮液制成濃度為5×104個/mL的混合病原菌孢子懸浮液。

1.3.4枯草芽孢桿菌培養液對板栗黑斑病病菌的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養液分別按照1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶250和1 ∶125的比例加入到30～40 ℃的PDA培養基中，搖動后倒入直徑為12 cm的培養皿中，待培養基冷凝后，分別接種10 μL濃度為5×104個/mL的混合病原菌孢子懸浮液。接種后的培養皿放入28 ℃的恒溫培養箱中培養，以不加枯草芽孢桿菌培養液的為空白對照，各重復3次。培養5 d后測定菌落直徑，計算平均抑制效果。

1.3.5枯草芽孢桿菌培養液對采后板栗黑斑病的抑制作用將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無菌水溶液配制成濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液。滅過菌的打孔針在每個板栗仁上刺一個3 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，分別接種20 μL枯草芽孢桿菌培養液，5 h后再接種濃度為5×104個/mL的混合病原菌孢子懸浮液10 μL。待傷口晾干后，將果實放于室溫下貯藏，以不接種枯草芽孢桿菌培養液的板栗仁為空白對照，每隔1 d測定果實的發病率。

1.3.6枯草芽孢桿菌代謝產物對板栗黑斑病病菌的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養液于4 ℃下8 000 r/min離心 10 min 后，取上清液，經過濾后得到濾液備用。將濾液分別按照1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶250和1 ∶125的比例加入到30～40 ℃的PDA培養基中，搖動后倒入直徑為12 cm的培養皿中，待培養基冷凝后，分別接種10 μL濃度為5×104個/mL的混合病原菌孢子懸浮液。接種后的培養皿放入28 ℃的恒溫培養箱中培養，以不加枯草芽孢桿菌培養液的為空白對照，各重復3次。培養5 d后測定菌落直徑，計算平均抑制效果。

1.3.7枯草芽孢桿菌代謝產物對采后板栗黑斑病的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養液于4 ℃下8 000 r/min離心 10 min 后，取上清液，經過濾后得到濾液備用。將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無菌水溶液配制成濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液。滅過菌的打孔針在每個板栗仁上刺一個3 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，分別接種20 μL枯草芽孢桿菌培養液濾液，5 h后再接種濃度為5×104個/mL的混合病原菌孢子懸浮液10 μL。待傷口晾干后，將果實放于室溫下貯藏，以不接種枯草芽孢桿菌培養液的板栗仁為空白對照，每隔1 d測定果實的發病率。

2結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌生長曲線的繪制

任何生物都有出生、發育、繁殖、衰老和死亡的過程。微生物也不例外。不過，微生物的生長規律和大生物有些不同，大生物通常是以一個個體為對象，而微生物的生長通常指細胞數目的增加。微生物的生長規律可以用生長曲線來呈現。典型的微生物生長曲線一般包括延滯期、對數期、穩定期和衰亡期4個階段。由圖1可以看出，因測定間隔時間較長，枯草芽孢桿菌生長的延滯期不太明顯，曲線中沒有呈現出來，接種后很快就進入快速生長的對數期，大概24 h后開始進入穩定生長期，培養時間大于60 h后，細胞數目開始減少，菌體開始衰老死亡。根據這個枯草芽孢桿菌生長曲線所呈現出的生長規律，選擇菌種活化后24 h的菌懸液進行抑菌研究，因為這個時期的枯草芽孢桿菌生長旺盛，活力強。

2.2枯草芽孢桿菌培養液對板栗黑斑病病菌的抑制作用

試驗測定結果表明，當枯草芽孢桿菌培養液的添加量為0時，病原菌菌落直徑為36.8 mm；當枯草芽孢桿菌培養液的添加量為1 ∶1 000時，病原菌菌落直徑為25.3 mm；當枯草芽孢桿菌培養液的添加量為1 ∶500時，病原菌菌落直徑為 8.6 mm；當枯草芽孢桿菌培養液的添加量為1 ∶250和 1 ∶125 時，病原菌都沒有生長。由此可見，枯草芽孢桿菌添加量越大，對病原菌的抑制效果越好。當枯草芽孢桿菌的添加量大于1 ∶250時，就能夠抑制板栗黑斑病病原菌的生長，并且抑菌效果能達到100%。

2.3枯草芽孢桿菌培養液對采后板栗黑斑病的抑制作用

由圖2可見，與不加枯草芽孢桿菌培養液的空白對照相比，添加了枯草芽孢桿菌培養液的板栗接種病原菌后在貯藏過程中發病率明顯要低很多。不加枯草芽孢桿菌培養液的板栗接種病原菌后發病很快，2 d之后病原菌的生長就進入快速生長對數期，大量板栗開始發病，4 d后，發病板栗基本上占到了90%，7 d后發病率達到了95%。而添加了枯草芽孢桿菌培養液的板栗，在貯藏過程中板栗發病的速度相比要慢得多，而且一直維持緩慢增長的趨勢，貯藏4 d后，發病率大概只有10%，貯藏7 d后發病的板栗也只有不到20%，比不加枯草芽孢桿菌培養液的板栗發病率降低了約75百分點。這說明枯草芽孢桿菌培養液能夠顯著抑制板栗采后黑斑病的發生。

2.4枯草芽孢桿菌代謝產物對板栗黑斑病病菌的抑制作用

試驗測定結果表明，當枯草芽孢桿菌培養液濾液的添加量為0時，病原菌菌落直徑為38.2 mm；當枯草芽孢桿菌培養液濾液的添加量為1 ∶1 000時，病原菌菌落直徑為29.5 mm；當枯草芽孢桿菌培養液濾液的添加量為1 ∶500時，病原菌菌落直徑為15.8 mm；當枯草芽孢桿菌培養液濾液的添加量為1 ∶250時，病原菌菌落直徑為7.5 mm；當枯草芽孢桿菌培養液濾液的添加量為1 ∶125時，病原菌沒有生長。由此可見，枯草芽孢桿菌的代謝產物也對病原菌的生長有一定的抑制作用?？莶菅挎邨U菌代謝產物添加量越大，對病原菌的抑制效果越好。當枯草芽孢桿菌代謝產物的添加量大于1 ∶125時，就能夠抑制板栗黑斑病病原菌的生長，并且抑菌效果能達到100%。對比枯草芽孢桿菌培養液對板栗黑斑病病菌的抑制作用試驗結果可以看出，濾液的抑菌效果不如菌懸液顯著。這可能是因為枯草芽孢桿菌的抗生作用是由芽孢桿菌及其代謝物質兩部分作用共同構成的[12]。

2.5枯草芽孢桿菌代謝產物對采后板栗黑斑病的抑制作用

由圖3可見，與空白對照相比，添加了枯草芽孢桿菌培養液濾液的板栗接種病原菌后發病率明顯低于不添加枯草芽孢桿菌培養液濾液的板栗。不加枯草芽孢桿菌培養液濾液的板栗接種病原菌后發病很快，2 d之后病原菌的生長就進入快速生長對數期，大量板栗開始發病，4 d后，發病板栗就達到了約90%。而添加了枯草芽孢桿菌培養液的板栗，在貯藏過程中發病速度要慢得多，而且一直維持緩慢增長的趨勢，貯藏7 d后，發病板栗約50%，比空白對照發病率低約45百分點。這說明枯草芽孢桿菌代謝產物也能夠顯著抑制板栗采后黑斑病的發生。但是對照枯草芽孢桿菌培養液對采后板栗黑斑病的抑制作用試驗結果可以看出，枯草芽孢桿菌培養液濾液的抗病效果沒有菌懸液的抗病效果顯著。這進一步印證了枯草芽孢桿菌的抗生作用是由芽孢桿菌及其代謝物質兩部分作用共同構成的，單純的代謝產物雖然也有抗病作用，但是效果不如既有菌體也有代謝產物存在的情況下好。

3結論

應用芽孢桿菌防治植物病害具有悠久的歷史，許多優良菌株已應用于生產實踐來防治果蔬、作物等的真菌、細菌病害[13]。其中，枯草芽孢桿菌以其安全、對人畜無害、不污染環境的特點，廣泛用于果蔬采后生物防治，如有文章報道，利用枯草芽孢桿菌可以防治桃褐腐病和荔枝果腐病[14]。

陳坤等對信陽板栗7種病原真菌進行了生物學研究，認為微生物侵染板栗果實，形成黑斑病，對板栗黑斑病進行病菌分離和鑒定，發現信陽板栗黑斑病常見7種病菌真菌，分別為炭疽菌（Collecto trium sp.）、鐮孢菌（Fusar ium sp.）、枝孢霉（Cladosporium sp.）、毛霉（Mucor）、疫霉（Phytophthora pasitica）、大莖點菌（Macrophoma sp.）和黃曲霉（Aspergillusflavus）[15]。試驗結果表明，枯草芽孢桿菌可以抑制板栗病原菌的生長繁殖，進而顯著降低板栗采后黑斑病的發病率?？莶菅挎邨U菌菌懸液可以使板栗采后黑斑病的發病率降低約75百分點，其濾液也可以使板栗采后黑斑病的發病率降低約45百分點。這說明枯草芽孢桿菌的抑菌作用是通過菌體和代謝物質共同實現的，而且其代謝產物的抑菌效果比菌體還要強，起主要的抑菌作用。由此也找到一條板栗采后保鮮的新途徑，可以為我國板栗在貯藏過程中延長貯藏期、降低腐爛率、提高經濟效益方面提供幫助。

參考文獻：

[1]王海霞，劉正坪，朱曉清，等. 板栗貯藏期致腐病原真菌種類鑒定及其侵染特性[J]. 北京農學院學報，2006，21（4）：33-36.

[2]吳小芹，林樹燕，熊春紅，等. 貯藏方式對板栗品質及其微生物種類數量消長的影響[J]. 南京林業大學學報：自然科學版，2001，25（3）：47-51.

[3]魯周民，吳萬興，李文華，等. 板栗低溫冷藏工藝及HACCP質量控制研究[J]. 食品科學，2003，24（8）：146-148.

[4]叢永亮，魯周民，段振軍，等. 焦亞硫酸鈉水浴處理對板栗貯藏效果的影響[J]. 食品科學，2008，29（5）：449-452.

[5]池明，魯周民，劉馳晏，等. 水楊酸處理對板栗冷藏品質及呼吸強度的影響[J]. 食品工業科技，2010，31（1）：347-349，353.

[6]蔣儂輝，鐘云，陳金印. 熱處理對板栗貯藏過程中部分生理指標與貯藏效果的影響[J]. 果樹學報，2004，21（3）：237-240.

[7]徐芬芬，葉利民. 殼聚糖涂膜板栗貯藏試驗[J]. 中國果樹，2010（5）：33-36.

[8]李莉，劉興華. 液膜處理對板栗貯藏效果影響[J]. 食品工業，2009（3）：38-40.

[9]黃海嬋，裘娟萍. 枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進展[J]. 浙江農業科學，2005（3）：213-215，219.

[10]劉雪，穆常青，蔣細良，等. 枯草芽孢桿菌代謝物質的研究進展及其在植病生防中的應用[J]. 中國生物防治，2006（增刊1）：179-184.

[11]陳潔，黃佩佩，宋茹. 枯草芽孢桿菌發酵魚蛋白制備抗氧化型發酵液工藝的初步研究[J]. 浙江海洋學院學報：自然科學版，2011，30（3）：254-258.

[12]王東昌，辛玉成，郝壽青，等. 板栗爛果病的生物防治研究[J]. 中國果樹，2001（3）：10-12.

[13]Chen Z Y，Zhang J，Huang D F. Research progress on antimicrobial mechanism genetic engineering of Bacillus for plant diseases biocontrol[J]. Acta Phytopathol Sin，2003，33（2）：97-103.

[14]齊東梅，惠明，梁啟美，等. 枯草芽孢桿菌H110對蘋果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果[J]. 應用與環境生物學報，2005，11（2）：171-174.

[15]譚正林，王利兵. 板栗貯藏病害及防治技術[J]. 湖北植保，2009，113（3）：53，56.韓燕，曹宏，高美須，等. 糯米藕的加工工藝與輻照保質[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：259-260.