利用異源酵母功能互補法研究水稻銨轉運體OsAMT1；1功能及調控機制

楊順瑛　叢郁　郝東利　等

摘要：水稻是一種以銨態氮為主要氮素營養的重要糧食作物，存在至少12個銨轉運體，對水稻銨的吸收起著至關重要的作用，其中，水稻銨轉運體1；1（Oryza sativa ammonium transporter1；1，OsAMT1；1）是一個在根部和地上部相對組成型表達的基因。通過異源酵母功能互補法研究水稻銨轉運體OsAMT1；1的功能及其調控機制，結果表明，OsAMT1；1是一個功能型的銨轉運體，和銨的同系物甲基銨（Methylammonium，MeA+）相比，OsAMT1；1對銨具有相對較高的選擇性；OsAMT1；1介導銨的吸收不依賴于外界質子，轉運的底物可能是銨離子；OsAMT1；1介導吸收銨的過程是一個依賴能量的主動運輸過程，對銨的吸收可能不受鈣離子參與的磷酸化過程調控。

關鍵詞：水稻；銨轉運體1；1；酵母功能互補；調控

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0027-04

收稿日期：2014-04-01

基金項目：國家自然科學基金重大研究計劃（編號：91125028）。

作者簡介：楊順瑛（1982—），女，湖北恩施人，博士，主要從事分子植物營養學研究。Tel：（025）86881553；E-mail：ysy@issas.ac.cn。

通信作者：蘇彥華，山東濟寧人，博士，教授、研究員，從事植物營養與分子生物學研究。E-mail：yhsu@issas.ac.cn。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，生長在淹水條件下，以銨為主要氮源[1]。銨轉運體（ammonium transporter，AMT）家族基因編碼的銨轉運系統，是水稻銨吸收和代謝的重要途徑[1-2]。水稻中至少存在12個銨轉運體基因，分為兩大家族，OsAMT1；1-1；3歸屬于AMT1家族，其余9個基因包括OsAMT2；1-2；3、OsAMT3；1-3；3、OsAMT4、OsAMT5；1-5；2歸屬于AMT2家族[3]，其中，有關水稻銨轉運體1；1（Oryza sativa ammonium transporter1；1，OsAMT1；1）基因的表達規律及超表達轉基因水稻的研究取得一定進展。 OsAMT1；1在根部和地上部更傾向于組成型表達，可能負責根部從外界吸收銨[2]；過表達研究表明，OsAMT1；1能夠增強銨的吸收和體內的銨含量[4]；和野生型相比，在銨次優和最優條件下，OsAMT1；1表達水平高于野生型20多倍，銨吸收速率明顯高于野生型，同時，體內高銨含量也促進氮同化途徑基因的表達，使體內氮同化產物、葉綠素、淀粉、糖類及產量都有較大提高，暗示OsAMT1；1有提高氮利用效率、植物生長及糧食產量的潛力[1]。然而，對OsAMT1；1銨轉運蛋白調控機制的研究進展不大。 本試驗采用酵母功能互補方法，初步研究不同外界pH值、銨的同系物甲基銨（methylammonium，MeA+）、羰基氰化間氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）及離子鈣（Ca2+）的螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸[ethyleneglycol-bis（beta-aminoethylether）-N，N′-tetraacetic acid，EGTA]等處理條件對OsAMT1；1的調控機制，以期為進一步解析OsAMT1；1在水稻銨代謝中的功能提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗用大腸桿菌菌株為Escherichia coli DH5α，中國科學院南京土壤研究所實驗室保存；所用表達宿主菌株為釀酒酵母銨轉運體缺失突變體31019b（mep1Δ，mep2Δ：：LEU2，mep3Δ：：KanMX2 ura3），由德國Hohenheim大學Nico Von Wirén教授惠贈，在外界銨作為唯一氮源且濃度低于5 mmol/L時，此菌株不能正常生長[5]；酵母表達載體pYES2，購于 Invitrogen 公司；YNB培養基，不含硫酸銨和氨基酸（yeast nitrogen base w/o ammonium sulfate and amino acids），購于Difco公司；D-半乳糖、精氨酸、氯化銨和甲基胺（methylammonium，MeA+），購于Sigma公司；PCR擴增高保真酶PrimeSTAR，購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶KpnⅠ和NotⅠ，購于New England Biolabs公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2酵母表達載體OsAMT1；1-pYES2的構建

參照文獻[3]中OsAMT1；1 ID號，從水稻基因組數據庫TIGR （http：//rice.plantbiology.msu.edu/）檢索OsAMT1；1的cDNA序列，大小為1 497 bp。設計引物OsAMT1；1-KpnⅠ-P1：5′-GTCGGTACCATGGCGACGTGCGCGGCGGACCTG-3′和OsAMT1；1-NotⅠ-P2：5′-GTCGCGGCCGCTTACACTTGGTTGTTGCTGTTGG-3′，以粳稻日本晴（Oryza sativa. ssp. Japonic Nipponbare） cDNA為模板，擴增OsAMT1；1基因。擴增條件為：95 ℃預處理5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用MN （MACHEREY-NAGEL）膠回收試劑回收，利用常規rTaq酶在無引物PCR反應體系中72 ℃反應20 min，將產物的3′端加上堿基A，然后連接到pMD18-T vector，轉化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司上海分公司測序。用限制性核酸內切酶KpnⅠ和NotⅠ，分別酶切測序正確的陽性克隆和酵母表達載體pYES2，回收并用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體大片段，轉化DH5α，篩選鑒定并獲得OsAMT1；1-pYES2 陽性克隆。

1.3酵母培養和轉化

采用電轉化儀Micro Pulser（Bio-Rad公司），將OsAMT1；1-pYES2和空載體pYES2分別轉入酵母銨轉運體缺失突變菌株31019b感受態細胞，電擊后加入1 mL預冷的 1 mol/L 山梨醇，30 ℃度溫育2 h，于酵母選擇性培養基（017% YNB+2 mmol/L精氨酸+2% D-半乳糖+2%瓊脂）平板上30 ℃黑暗培養3 d；挑取單菌落在酵母液體選擇培養基中30 ℃振蕩培養36 h，經PCR鑒定為陽性的單菌落即為重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019 b。重組酵母菌株在YNB液體選擇性培養基上培養至D600 nm為1.0，經10倍梯度稀釋成10-1、10-2、10-3 3個濃度，分別取4個濃度梯度的菌液5 μL，點樣于以2 mmol/L精氨酸，或pH 值為5.8、不同濃度NH4Cl為唯一氮源，或2 mmol/L NH4Cl 為唯一氮源，pH值分別為4.8、5.8、6.8和不同處理試劑（EGTA，MeA+或CCCP）的固體培養基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2%瓊脂）上，于30 ℃黑暗培養，觀察菌落生長狀況并適時拍照。 所有處理均以轉空載體pYES2的31019b酵母pYES2/31019b為對照。

2結果與分析

2.1OsAMT1；1-pYES2載體構建

以水稻Nipponbare cDNA為模板，以OsAMT1；1-KpnⅠ-P1 和OsAMT1；1-NotⅠ-P2為引物，進行PCR擴增，獲得長度為1 497 bp的產物（圖1-a）；純化并連接pMD18-T載體，經轉化、篩選和測序獲得陽性克隆OsAMT1；1-pMD18-T；用KpnⅠ和NotⅠ分別酶切質粒OsAMT1；1-pMD18-T和pYES2，膠回收獲得線性目的片段OsAMT1；1和pYES2載體大片段，用T4 DNA 連接酶連接目的片段和載體大片段，16 h 后經轉化篩選鑒定，獲得陽性質粒OsAMT1；1-pYES2，其酶切驗證圖譜見圖1-b，OsAMT1；1-pYES2質粒構成見圖 1-c。將獲得的陽性質粒電轉化至31019b酵母感受態細胞，獲得陽性重組菌株用于本研究。

2.2OsAMT1；1的酵母功能互補結果

試驗結果表明，在以2 mmol/L 精氨酸為唯一氮源的固體培養基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L精氨酸+2%瓊脂）上，轉化了OsAMT1；1-pYES2和空載體pYES2的菌株都能正常生長（圖2-a）；在以0.02、0.2、2 mmol/L NH4Cl為唯一氮源的培養基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+不同濃度的銨+2%瓊脂）上，轉化空載體的酵母pYES2/31019b不能正常生長，而轉化了OsAMT1；1-pYES2的重組酵母能夠正常生長（圖2-b），并隨銨濃度不斷升高，重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生長得越好。這說明OsAMT1；1具有吸收銨的功能，能夠介導銨的吸收。

2.3甲基銨對OsAMT1；1吸收銨功能的影響

甲基銨是銨的有機同系物，通常作為銨的競爭吸收底物而用于研究銨轉運體的功能[6-7]。由圖3可見，在017%

YNB、2% D-半乳糖和25 mmol/L MeA+固體培養基上培養48 h或96 h，轉化了OsAMT1；1的酵母菌株能夠生長，而照菌株生長極其微弱，甚至觀察不到生長跡象，這表明OsAMT1；1能夠吸收甲基銨，并以其為氮源促進31019b的生長；在017% YNB、2% D-半乳糖和100 mmol/L MeA+固體培養基條件下，轉化了OsAMT1；1的酵母菌株可能吸收過多的甲基銨而致死；在銨和甲基銨共存時（0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH+4添加25 mmol/L或100 mmol/L MeA+），轉化了OsAMT1；1的酵母菌株生長恢復正常，這些均表明OsAMT1；1也能夠介導吸收甲基銨，在銨和甲基銨共存時，OsAMT1；1會優先吸收銨，對銨具有較高選擇性。

2.4外界pH 值對OsAMT1；1功能的影響

在2 mmol/L NH+4作為唯一氮源、pH值分別為4.8、5.8、6.8）的固體培養基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L銨+2%瓊脂）上，轉化空載體的酵母pYES2/31019b不能正常生長，重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生長良好（圖4）。這說明OsAMT1；1轉運銨的能力可能與外界質子無關，對銨的吸收可能不受外界質子的調控，并且OsAMT1；1轉運體蛋白轉運銨的底物是離子態銨。

2.5CCCP對OsAMT1；1功能的影響

羰基氰化間氯苯腙（CCCP）是一種解偶聯劑[8]，最早用于研究線粒體和葉綠體的氧化磷酸化解偶聯過程[9]。在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固體培養基中添加100 μmol/L CCCP時，轉化了OsAMT1；1的酵母和對照菌株幾乎都觀察不到生長跡象（圖5），CCCP強烈抑制OsAMT1；1對銨的吸收，OsAMT1；1的吸銨過程可能是一個依賴能量的主動運輸過程。

2.6EGTA對OsAMT1；1功能的影響

乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）是一種鈣離子螯合劑，在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固體培養基中添加 1 mmol/L EGTA 時培養48、96 h， 重組酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b能夠正常生長，和未添加EGTA的YNB 培養基上幾乎沒有差別（圖6）， OsAMT1；1對銨的吸收可能不受Ca2+參與的磷酸化過程調控。

3結論與討論

植物從土壤環境中吸收銨主要由高親和與低親和的轉運系統介導，在銨濃度大于1 mmol/L時，一般認為，主要通過離子通道調控銨的內流[10-12]；當外界銨濃度小于1 mmol/L時，主要是通過高親和銨轉運系統介導銨的吸收[13-14]。在通氣良好的農業土壤中，硝酸鹽是主要的無機氮形式，植物吸收的硝酸大于銨，相反，在通氣不良的農業土壤尤其是水田，銨是主要的無機氮形式。 水稻是一種喜銨和耐銨的作物[15-16]，在整個生育期幾乎全部以銨態氮為營養[2]。OsAMT1；1能夠介導銨的吸收，是一個功能型的銨轉運體，在外界銨為唯一氮源的條件下，能夠互補銨轉運體缺失突變體酵母菌株31019b的生長[2]，并隨外界銨濃度的升高，重組菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b 的生長越好。在外界銨濃度變化的情況下，OsAMT1；1對銨的吸收起著非常重要的作用。

長期以來，植物AMT吸收轉運銨是以分子態NH3還是離子態銨一直是研究者們關注的焦點。在外界不同pH 值條件下，重組菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長狀況幾乎沒有差別，OsAMT1；1轉運體蛋白對銨的吸收不受外界質子的調控，轉運的底物是銨離子而非分子態NH3，和PcAMT1-1類似[17]，可能都是不受外界質子調控的銨轉運體。電生理手段證明，當外界pH從酸性值變化為堿性時，銨轉運體介導的電流大小和方向幾乎沒有改變，這與擬南芥AtAMT1；1、番茄LeAMT1；1轉運銨不依賴于外界質子的轉運機制結論[13，18]吻合。對于OsAMT1；1的詳盡轉運機制，需要進一步用電生理手段完善。

高親和的轉運系統介導銨的內流通常依賴于代謝能量，解偶聯劑CCCP能夠使高親和轉運系統介導銨的內流下降81%～87%[19]。在銨作為唯一氮源的YNB選擇性培養基中添加100 μmol/L CCCP，幾乎觀察不到重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長，OsAMT1；1對銨的吸收轉運是一個依賴能量的主動運輸過程。

鈣是植物生長發育的一種重要信號轉導分子，植物體內CBL（Calcineurin B-like Protein）被鈣離子活化后，能激活 CIPK（CBL-Interacting Protein Kinase）基因蛋白來影響植物的生長發育及響應逆境脅迫信號[20-21]。擬南芥鉀轉運體AKT1的轉運活性受CIPK23磷酸化調控，CIPK23受上游CBL1和CBL9激活，從而增強植物在外界低鉀條件下對鉀素的吸收[20]。本研究初步探索鈣對OsAMT1；1的調控特征，OsAMT1；1-pYES2/31019b在施加鈣的螯合劑EGTA 1 mmol/L 的固體培養基上生長48、96 h，與未加EGTA的生長幾乎沒有差別，OsAMT1；1對銨的吸收轉運可能不受鈣信號參與的磷酸化過程調控，其調控機制尚需進一步深入研究。

甲基銨是銨的有機同系物，通常作為銨的吸收底物或競爭吸收底物研究銨轉運體的功能特征[6-7，13]，人紅血細胞中的銨轉運體同族體RHCG能夠介導甲基銨的電中性轉運，對甲基銨的吸收速率隨外界pH值增加而增加[7]。本研究中，當以 25 mmol/L 甲基銨為唯一氮源時，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b能夠生長，而對照菌株pYES2/31019b不能生長，這表明OsAMT1；1能夠介導甲基銨的吸收；當外界甲基銨濃度為100 mmol/L時，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b幾乎沒有生長，可能是吸收甲基銨過量而致死。當在25 mmol/L或 100 mmol/L 甲基銨條件下補充2 mmol/L NH+4時，重組菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生長恢復正常，表明在銨和甲基銨共存的條件下，OsAMT1；1會優先、更多地吸收轉運銨，對銨具有較高的選擇性，這也表明OsAMT1；1在對水稻銨營養吸收方面具有至關重要的作用。

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