過表達肝細胞核因子4α臍帶間充質干細胞促進小鼠大部肝切后肝再生

吳 寧，馬 永，翟秀宇，張玉玲，張 勇，張祺祺，杭化蓮，夏 強，卞建民*

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過表達肝細胞核因子4α臍帶間充質干細胞促進小鼠大部肝切后肝再生

吳 寧1，馬 永1，翟秀宇2，張玉玲3，張 勇1，張祺祺4，杭化蓮4，夏 強4，卞建民1*

（1南京醫科大學附屬南京醫院普外科，南京 210006；2吉林大學第一醫院泌尿外二科，吉林 130021；3遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，遵義 563003；4上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院肝臟外科，上海 200127）

探討人源性臍帶間充質干細胞（UC-MSC）以及過表達肝細胞核因子4α（HNF4α）的UC-MSC能否促進小鼠大部肝切后肝再生。體外分離、培養、鑒定人UC-MSC，慢病毒轉染過表達HNF4α。體外收集細胞培養上清液，將L02與上清液共培養，通過細胞增殖實驗試劑盒（CCK8）檢測細胞增殖活性。體內實驗建立肝大部切除模型（約70%），分別經尾靜脈向肝切除小鼠移植0.9%生理鹽水（NS）、MSC、MSC-HNF4α。48h后比較3組肝切后肝再生的變化，通過免疫組化來觀察肝標本Ki67的表達。成功分離鑒定UC-MSC，并且成功建立穩定過表達HNF4α的MSC。體外實驗MSC組和MSC-HNF4α組中L02的增殖能力都明顯高于NS組（＜0.01），MSC組高于MSC-HNF4α組（＜0.05）。同樣體內實驗相對于NS組，經MSC或MSC-HNF4α細胞處理的肝臟，其Ki67的表達明顯高于NS組（＜0.01），同樣MSC組高于MSC-HNF4α組（＜0.05）。UC-MSC和過表達HNF4α的MSC都分泌一系列因子促進肝再生。

小鼠；肝再生；間充質干細胞；肝細胞核因子4α

肝臟作為機體重要的代謝器官，在受到各種因素的損傷后表現出極強的自我修復能力。雖然肝細胞屬于終末分化細胞，生理條件下主要處于靜息狀態，但一旦肝受到損傷后便會通過各種途徑對受損肝進行代償修復，在短期恢復原來大小，以滿足機體需求[1]。然而很多嚴重肝損傷及肝衰竭患者，肝再生能力無法滿足機體需求，既不耐受肝切除手術，也因為不能獲得及時進行原位肝移植的機會從而錯失治療時機。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）作為一種多能干細胞，具備強大的增殖能力、多向分化能力以及免疫調節能力，已獲廣泛認可。目前，很多學者將目光投向采用MSC治療各種類型的肝臟疾病，結果證明MSC能夠改善多種肝臟疾病[2?4]。MSC移植治療丙肝性肝硬變等在臨床試驗中也均取得了較好的療效[5]。還有研究發現將MSC在體外通過人工誘導成為“肝樣細胞”后移植于患者，同樣具有改善肝功能不全的效應，且這種肝樣細胞聚集到肝的能力強于MSC[6?8]。

肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α），作為細胞核受體超家族成員，是肝細胞分化和功能維持最為關鍵的轉錄因子[9]。我們前期研究發現，在同樣誘導條件下將HNF4α過表達于MSC后發現其誘導成為肝樣細胞的效果明顯強于對照組[10]。

本次試驗主要探討MSC是否能夠促進大部肝切后肝再生，以及過表達HNF4α的MSC對肝再生的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

足月剖宮產臍帶（上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院婦產科）；改良型RPMI1640培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（HyClone，美國）；DMEM/F12培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）,脂肪誘導液、成骨誘導液、軟骨誘導液（Gibco，美國）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（Invitrogen，美國）；HNF4α過表達慢病毒（吉凱基因，中國）；流式抗體、免疫組化抗體（BD，美國）；細胞增殖實驗試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（同仁，日本）；6周齡BALB/c小鼠（上海斯萊克，中國）。儀器包括高速臺式冷凍離心機（Eppendorf，德國），酶標儀（Biotek，美國），FACS Calibur流式細胞儀（BD，美國），免疫共聚焦（萊卡，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）的分離培養 在征得家屬同意簽署知情同意書并且經醫院倫理委員會同意后取健康足月剖宮產胎兒臍帶，沖洗臍帶中殘留血液，剝離臍帶外層羊膜以及內部2根動脈1根靜脈，將臍帶剪碎成肉糜狀（1mm×1mm×1mm的組織塊），培養皿中貼壁1h后加入適量含10%FBS、1μg/L bFGF的DMEM/F12完全培養基，5%CO2、37℃培養箱中培養，7d后半量換液，待MSC貼壁后移除組織塊，觀察細胞生長情況，至細胞融合度約達80%，0.25%胰酶消化后按1∶3比例傳代培養。

1.2.2 UC-MSC流式鑒定和分化鑒定 取第3代融合度80%UC-MSC，消化離心后PBS洗滌2次，計數每流式管中加入細胞2×105/ml，200μl PBS重懸細胞，按抗體使用說明書中的量加入流式直標抗體各10μl CD90、CD105、CD29、CD31、CD34、HLA-DR，4℃暗室孵化30min，PBS離心洗滌2次，流式固定液固定后上機檢測，數據采用Flowjo7.6分析。取第3代UC-MSC接種于預置蓋玻片的6孔板中，分別添加不含血清脂肪誘導液、成骨誘導液和軟骨誘導液誘導培養，1周換液2次，持續3周。分別將誘導后的細胞通過油紅染色、茜紅染色和檢測Ⅱ型膠原表達的方式檢測誘導效果。

1.2.3 構建人HNF4α慢病毒載體 設計HNF4α全長引物，上游5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGT- CGCCACCATGCGACTCTCCAAAACCCTC-3'，下游5′-TCCTTGTAGTCCATACCGATAACTTCCTGCTT-GGTGATG-3′。提取原代肝細胞總RNA進行RT-PCR，反應條件為94℃預變性2min，94℃解鏈30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環33次，72℃總延伸10min，4℃終止反應。擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并純化目的基因片段。將純化的目的基因片段交由公司測序驗證，構建慢病毒載體。所構建載體包括含HNF4α過表達載體，以及不含HNF4α的對照載體，上述慢病毒均自帶綠色免疫熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因。

1.2.4 轉染HNF4α 將第3代MSC接種于6孔板，確保次日貼壁后融合度約為30%。次日換液，將1×108TU慢病毒（MOI＝50）加于2ml含5mg/L聚凝胺（Polybrene）的感染增強液（enhanced infection solution）中，混勻用于培養細胞。8h后棄上清轉染液，PBS清洗3遍，加10%FBS培養液2ml，常規培養，2d換液，5d后共聚焦觀察熒光以檢測病毒轉染效率。

1.2.5 收集上清檢測分泌蛋白 將MSC和MSC-HNF4α分別接種于25cm2培養瓶，待其融合度約達70%，PBS清洗3遍，換不含血清DMEM/F12培養基6ml，常規培養48h后收集上清。兩組分別3個不同批次各取上清2ml，送至上?？党缮锕こ逃邢薰静捎肦ayBio?人L系列抗體芯片Ⅰ（507）檢測上清液中各種因子表達情況，以及比較兩組間分泌蛋白表達差異。其余上清-80℃長期保存，待用。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖活性 本次實驗體外采用L02肝細胞系作為普通肝臟細胞，消化離心對數生長狀態L02細胞，含10% FBS的RPMI1640完全培養基重懸計數使其密度為1×105/ml，100μl接種至96孔板，過夜待其完全貼壁，吸去培養基。設3組（＝5）：對照組，MSC組和MSC-HNF4α組分別添加DMEM/F12，MSC和MSC-HNF4α上清各75μl，最終加RPMI1640完全培養液使每孔補足100μl，5%CO2、37℃培養箱中培養24h。每孔加10μl CCK-8溶液，孵箱內繼續孵化1.5h后用450nm波長酶標儀分別檢測OD值。

1.2.7 小鼠肝切模型建立和檢測 8周齡，體質量約20g雄性BALB/c小鼠18只。術前2h，隨機分3組（＝6），分別注射生理鹽水（normal saline, NS）、5×106/ml MSC、5×106/ml MSC-HNF4α 200μl。小鼠肝切術參照姚菊芳小鼠大部肝切術的改進，60mg/kg戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，于劍突下腹中線剪開約2cm長切口，打開腹腔。顯微鏡下，分別結扎左外葉及中葉（約70%肝體積）血管，并切除，觀察創面無滲血后縫合關閉腹腔。48h后統一活殺小鼠，下腔靜脈采血1ml做丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）和白蛋白（albumin，ALB）檢測，取剩余部分肝4%多聚甲醛固定，其余肝組織立即投入液氮長期保存。石蠟包埋固定24h肝組織，切片，常規HE染色觀察肝組織病理變化。按照免疫組化說明書檢測肝組織中增殖細胞核抗原Ki67表達，判定標準：以細胞核呈界限清楚的棕色反應為陽性，每張切片隨機觀察5個高倍視野（×400倍），對其中的表達陽性細胞進行計數。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。數據均用均數±標準差表示，指標比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用檢驗。＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MSC的形態與鑒定

組織塊貼壁培養2周后可見從組織塊邊緣游離出部分MSC,移除組織塊后繼續培養1周使細胞融合度約達80%傳代，傳代后細胞生長速度加快，排列規則，形態大多呈梭形、多邊形及不規則形（圖1A）。在脂肪、成骨、軟骨誘導液中誘導3周后的MSC形態明顯發生改變，多趨向扁平狀，油紅染色、茜紅染色和Ⅱ型膠原表達陽性（圖1B，1C，1D）。細胞流式鑒定發現細胞高表達間充質細胞相關抗原CD29、CD90、CD105，而低表達造血細胞相關抗原CD31、CD34和HLA-DR（圖2）。

2.2 免疫共聚焦檢測HNF4α轉染效率

慢病毒轉染5d后，免疫共聚焦觀察MSC中GFP表達情況以鑒定其轉染效率，結果顯示轉染效率＞90%（圖3），細胞形態未發生明顯改變。

2.3 細胞上清液促進L02增殖活性

將各組上清培養L02細胞24h后，通過CCK-8測得OD值，結果發現MSC-HNF4α組L02增殖活性明顯高于NS組[（1.278±0.071）（1.031±0.047），＜0.01]，同樣MSC組也高于NS組[ （1.964±0.074）（1.031±0.047），＜0.01；圖4]。提示：在體外條件下，MSC和MSC-HNF4α培養上清液中的物質都具備促進L02細胞增殖的分泌物質，且在沒有免疫調節的環境下MSC分泌物對肝細胞的增殖作用強于過表達HNF4α的MSC細胞（＜0.05；圖4）。

2.4 移植細胞促進大部肝切肝再生

尾靜脈注射細胞（或NS）2h后，開腹行70%肝切除，48h后18只小鼠均存活，并且活力飲食基本恢復正常。統一活殺后，各組小鼠肝大小大致相似。同一部位HE染色未見明顯差別，均可見少量炎性細胞浸潤，膽小管增生，肝細胞增生（圖5）。免疫組化測得肝再生指標Ki67表現一致，均為MSC組明顯高于NS組[（45.000±5.263）（12.333±2.516），＝0.001]和MSC-HNF4α組[（45.000±5.263）（23.000±4.000），＝0.007]，同時MSC-HNF4α組上述指標陽性率高于NS組[（23.000±4.000）（12.333±2.516），＝0.017；圖6]。提示在體內存在免疫調節環境下，MSC和MSC-HNF4α同樣具有促進肝再生的能力，并且過表達HNF4α后對肝再生的促進能力弱于正常MSC。

圖1 MSC形態以及分化鑒定

Figure 1 Identification of MSC morphology and differentiation

MSC: mesenchymal stem cells; A: the third-passage UC-MSC (×100); B: after adipogenic induction, many small lipid vacuoles are observed by Oil Red O staining (×400); C: after chondrogenic induction, MSC differentiate into chondrogenic-like cells and are positive for typeⅡcollagen (×100); D: after osteogenic-specific induction, MSC are positive for Alizarin red staining (×100)

圖2 第3代MSC流式細胞鑒定結果

Figure 2 Identification of the third-passage human UC-MSC by flow cytometry

UC-MSC: umbilical cord mesenchymal stem cells. Flow cytometric analysis shows MSC cells are positive for CD29, CD 90 and CD105, and negative for CD31, CD34 and HLA-DR

圖3 MSC轉染慢病毒

Figure 3 Transfection of HNF4α into MSC (×200)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4α: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: overexpression HNF4α group

圖4 體外實驗MSC和MSC-HNF4α促進L02增殖

Figure 4 MSC and MSC-HNF4α promote L02 proliferation

NS: normal saline; MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α. Compared with NS group,**<0.01; compared with MSC group,#<0.05

2.5 蛋白芯片兩組細胞分泌物差異

收集兩組細胞上清各3份，采用RayBio?人L系列抗體芯片Ⅰ（507）檢測上清液中各種因子表達情況，發現兩組上清液中分泌因子存在較大差異（圖7）。而在這些因子中我們發現，MSC和MSC-HNF4α能分泌大量促進肝細胞再生因子：肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、轉化生長因子β、（transforming growth factor-beta，TGFβ）、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、胰島素等，而過表達HNF4α的MSC表達更多的HGF、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）及分泌型卷曲蛋白1（secreted frizzled-related proteins 1，sFRP-1）等多種因子，差異具有統計學意義。

3 討 論

肝臟再生是一個極其復雜的過程，包括啟動階段、增殖階段和終止階段3個步驟。目前，普遍接受的學說認為，肝切后血液流體剪應力發生改變，從而促進肝間充質細胞分泌胰島素、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、HGF、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和IL-6等多種細胞因子[11]，作用于肝實質細胞，并且激活wnt等多條相關信號通路[12]，啟動肝實質細胞通過有絲分裂代償再生。一些研究發現，當大部分肝細胞死亡或肝毒性物質持續作用時，肝臟中的干細胞即卵原細胞通過快速增殖分化參與肝再生；肝受到更嚴重損傷后，骨髓MSC、胰腺干細胞等可經血流停留于肝參與肝再生[13,14]。有研究結果表明，體外誘導分化后的MSC具備治療多種肝臟疾病的潛力[8,15,16]。本研究小組在前期研究中已證實，將HNF4α過表達于MSC能夠誘導更趨成熟肝細胞的肝樣細胞[10]。

本次實驗，我們采用UC-MSC，是因為UC-MSC相對于傳統骨髓或者脂肪來源的MSC具備更好的原始特性，并且具備更好的免疫調節能力，原料的獲取和分離也較后者更加容易。我們將HNF4α通過慢病毒轉染的方式過表達于MSC，并且收集MSC和MSC-HNF4α條件培養基。通過體外增殖實驗，我們證實MSC和MSC-HNF4α的外分泌因子都能夠促進L02的增殖效應，而且MSC組的促增殖作用較MSC-HNF4α組明顯。經尾靜脈注入MSC組動物殘肝中Ki67的表達高于MSC-HNF4α組（但兩組都明顯高于對照組）。為了解釋上述現象，我們采用抗體芯片技術檢測兩組細胞外分泌因子。通過比對兩組芯片結果差異，我們發現MSC以及MSC-HNF4α能夠分泌大量促進肝細胞再生的關鍵性因子，如HGF、TGFβ、FGF、IL-6、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等。不過，MSC-HNF4α不僅能夠更多地分泌HGF（＜0.05），而且還能大量分泌sFRP-1。sFRP-1作為wnt信號通路的上游競爭性抑制因子，能夠有效抑制wnt信號通路的激活而導致其下游的關鍵性因子β?連環蛋白（catenin）抑制。肝切除后殘肝再生啟動過程中，β?連環蛋白的激活有至關重要的作用[17]。我們認為MSC-HNF4α組中抑制因子sFRP-1的高表達能夠合理地解釋MSC-HNF4α促再生能力弱于未經處理的MSC。

圖5 各組小鼠肝臟HE染色未見明顯差別

Figure 5 HE-staining of liver tissue shows no difference between different groups (×200)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: MSC group; C: overexpression HNF4α group

圖6 MSC和MSC-HNF4α促進肝再生（Ki67表達）

Figure 6 MSC and MSC-HNF4α promote liver proliferation(Ki67 experssion, ×400)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: MSC group; C: MSC-HNF4α group; D: the expression of Ki67 in each group. Compared with NS group,**<0.01; compared with MSC group,#<0.05

圖7 抗體芯片檢測MSC和MSC-HNF4α上清分泌蛋白

Figure 7 Detection of secreted proteins in supernatant of MSC and MSC-HNF 4α by antibody microarray

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: MSC group; B: MSC-HNF4α group

在體外大量獲取“肝樣細胞”建立工程化肝細胞株用于細胞移植或組織工程肝，有望成為今后治療肝衰竭的方法。我們認為，由于MSC-HNF4α能夠分泌更多因子以及能夠更好地分化成為肝樣細胞，其可能會在肝衰竭尤其是慢性肝衰竭的治療中發揮重要作用。

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（編輯: 周宇紅）

Overexpression of hepatocyte nuclear factor 4α in umbilical cord mesenchymal stem cells promotes liver regeneration after subtotal hepatectomy in mice

WU Ning1, MA Yong1, ZHAI Xiu-Yu2, ZHANG Yu-Ling3, ZHANG Yong1, ZHANG Qi-Qi4, HANG Hua-Lian4, XIA Qiang4, BIAN Jian-Min1*

(1Department of General Surgery, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China;2the Second Department of Urology, the First Hospital of Jilin University, Jilin 130021, China;3Guizhou Provincial Key Laboratory of Cell Engineering, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563033, China;4Department of Liver Surgery, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China)

To investigate whether human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSC) and the cells with overexpression of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) can promote liver regeneration after subtotal hepatectomy in mice.After human UC-MSC were isolated, cultured and identified, the cells were transfected with lentiviral vector LV-HNF4α. Then the cell supernatant was collected and cultured with L02 cells, and the L02 cell viability was detected by cell counting kit-8 (CCK8) assay. In thestudy, a total of 18 mice were randomly divided into 3 groups (=6 for each group): normal saline (NS) group, MSC group and MSC-HNF4α group, and received an injection of NS, MSC and MSC-HNF4α (5×106/ml), respectively via tail vein in 2 h before the establishment of subtotal hepatectomy model (70%). In 48 h later, the expression of Ki67 in the liver tissues was detected by immunohistochemical assay, and the results were compared among 3 groups.UC-MSC was successfully isolated from human umbilical cord, and the UC-MSC with stable overexpression of HNF4α were established.study indicated that the L02 cells showed stronger proliferative ability when cocultured with MSC and MSC-HNF4α than cultured alone (＜0.01), and those cocultured with MSC-HNF4α stronger than the cells with MSC (＜0.05).study showed similar findings: the expression of Ki67 was stronger in the mice treated with MSC or MSC-HNF4α than those with NS (＜0.01), and also overexpression of HNF4α resulted in more significant expression of Ki67 (＜0.05).Both MSC and MSC-HNF4α secret some cytokines to promote liver regeneration.

mice; liver regeneration; mesenchymal stem cells; hepatocyte nuclear factor 4α

(201308014),(81100306)(134119a9501).

R333.4

A

10.11915/j.issn.1671?5403.2015.01.016

2014?09?17;

2014?11?06

南京市科學技術委員會基金（201308014）；國家自然科學基金 (81100306)；上海市科委醫學引導類基金(134119a9501)

卞建民, E-mail: jmbian0324@gmail.com