桑白皮化學拆分工藝及互不交叉性研究

王小蘭 王 紳 趙 威 張艷麗 張明輝 匡海學 馮衛生 鄭曉珂

(1 河南中醫學院，鄭州，450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發河南省創新中心，鄭州，450046；3 黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

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桑白皮化學拆分工藝及互不交叉性研究

王小蘭1,2王 紳1,2趙 威1,2張艷麗1,2張明輝1,2匡海學3馮衛生1,2鄭曉珂1,2

(1 河南中醫學院，鄭州，450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發河南省創新中心，鄭州，450046；3 黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

目的:建立桑白皮全成分的拆分工藝，并對各拆分組分進行互不交叉性研究與工藝穩定性考察。方法：首先采用水煎、萃取、醇沉、大孔吸附樹脂等技術建立桑白皮化學組分的拆分方法；然后運用HPLC-PDA、HPLC-ELSD色譜法與ChemPattern化學計量學軟件相結合，采用主成分分析法與聚類分析法探討各拆分組分是否有交叉。結果：桑白皮的全成分拆分為5個組分，將不同檢測器的HPLC色譜數據結合化學計量學分析，結果顯示各拆分組分互不交叉，該工藝所得10批次各拆分組分，通過HPLC-PDA特征圖譜研究，進行相似度評價，工藝穩定。結論：本研究建立了穩定的桑白皮化學組分拆分工藝，該工藝穩定、重現性良好，各個拆分組分基本無化學成分交叉。

桑白皮化學拆分工藝；HPLC-PDA；HPLC-ELS；互不交叉性分析；化學計量學分析

中藥性味理論是中藥藥性理論的核心，是幾千年來中醫臨床用藥的重要依據，近年來，隨著中醫藥現代化研究發展，有關中藥藥性研究也日益增多，本研究首席科學家匡海學教授提出來“一藥X味Y性(Y≤X)。中藥性味的物質基礎是可拆分性、可組合性”的中藥性味理論研究新假說，遵循這一理論，本研究以桑白皮為研究對象，采用中藥性味可拆分性的研究模式[1]，結合現代儀器分析技術，對桑白皮化學組分拆分工藝進行研究，并且應用ChemPattern軟件對各拆分組分進行化學計量學分析，探討各拆分組分互不交叉性與工藝的穩定性，為進行桑白皮性味藥理評價奠定基礎。

1 材料

1.1 藥材 所用桑白皮購自鄭州市中藥材市場，由河南中醫學院陳隨清教授鑒定為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮。

1.2 設備與試劑 Waters2695高效液相色譜儀，2998PDA檢測器，Waters 2424ELSD檢測器；BIOMATE3S型紫外分光光度計(美國熱電)；Empower色譜數據工作站；ChemPattern化學計量學系統解決方案軟件(科邁恩科技有限公司)；BT-25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯)；Arium 611 VF超級組合型超純水器(SARTORIUS)，Q-250A3粉碎機；流水式抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)；SK2200H型超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；SB-1000型旋轉蒸發器(上海愛朗儀器有限公司)；迪馬PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；DiaionHP-20大孔吸附樹脂(日本三菱公司)，甲醇(美國天地公司，色譜醇)；乙腈(美國天地公司，色譜醇)；95%乙醇(北京化工廠，分析純)；水(超純水)。

2 方法與結果

2.1 桑白皮各化學組分拆分工藝的研究 桑白皮水煎液提取方法考察：影響傳統中藥湯劑質量的主要因素包括加水量、煎煮次數及煎煮時間等。因此本研究采用L9(33)正交實驗考察上述3因素對桑白皮水煎煮提取率的影響，確定工藝為：10倍量水煎煮3次，每次1 h。

桑白皮全成分提取工藝建立：桑白皮1000 g，10倍量水煎煮3次，每次1 h，紗布過濾，合并濾液，濃縮干燥得桑白皮水煎液，提取率為17%。

桑白皮全成分拆分工藝建立：桑白皮水煎液減壓濃縮，加其2倍量的石油醚萃取，上清液濃縮回收溶劑后真空干燥6 h，得石油醚組分(該組分為脂肪油拆分組分)，提取率為3.10%，其余水提液上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脫，得到桑白皮30%、50%、80%乙醇拆分組分，提取率分別為5.8%、0.31%、0.25%，其中，水洗脫部分經過醇沉得到多糖拆分組分，提取率分別為4.4%。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取桑白皮25 g，10倍量的水提取3次，提取時間為1 h，提取液經減壓濃縮、離心、過濾，將所得濾液濃縮至干，加入流動相超聲溶解，定容于50 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 桑白皮水煎液色譜條件建立[2-5]色譜柱為迪馬PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以流動相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速：1.0 mL/min，檢測波長：280 nm。

2.4 方法學考察 方法學考察中進行了精密度、穩定性的研究，結果表明儀器精密度符合要求，標準品在24 h內穩定，樣品處理操作重現性良好，保證了實驗結果的準確、可靠。

表1 桑白皮水煎液HPLC梯度洗脫條件

2.4.1 精密度試驗 取同一批桑白皮藥材，按“2.2”項制備供試品溶液，按上述色譜條件各拆分組分分別連續進樣6次，以考察儀器重現性。色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，計算保留時間及峰面積的RSD值。其RSD值均小于3%，表明色譜系統精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一批桑白皮藥材，按“2.2”項制備供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h測定HPLC色譜圖，以考察24 h內的穩定性。色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，計算保留時間及峰面積的RSD值。RSD小于3%，表明樣品在24 h內性質穩定。

2.5 桑白皮化學拆分組分互不交叉性研究 根據2.1中拆分工藝得到的5個拆分組分，在建立了桑白皮水煎液HPLC色譜條件的基礎上，本實驗對各拆分組分的互不交叉性進行研究，在桑白皮的5個拆分組分中脂肪油組分、揮發油組分以及醇沉組分，因沸點與分子量差異較大，不存在與其他組分交叉，故本實驗采用HPLC-PDA色譜法主要對桑白皮的30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脫組分進行了初步互不交叉研究，為下一步深入研究奠定基礎。

2.5.1 桑白皮水煎液HPLC-PDA色譜條件下的結果 將“2.1”項下制備的各拆分組分樣品，按確定的桑白皮水煎液HPLC色譜條件進行測定，并將各圖譜進行疊加。根據出峰情況，可以看出，各拆分組分與水煎煮總提物相比基本上未出現成分缺失，基本實現了全成分拆分。從保留時間上可以觀察到：30%乙醇洗脫組分集中在0—45 min，50%乙醇洗脫組分集中在35—65 min，80%乙醇洗脫組分集中在60 min以后。各拆分組分且峰值較高的成分從保留時間來看，基本上無重疊，提示個拆分組分成分基本無交叉，結果見圖1。

2.5.2 采用不同流動相及檢測器進一步確認各組分的互不交叉性 中藥成分非常復雜，為了進一步確認結果的準確與可靠，全面檢測各拆分組分化學成分之間的互不交叉性，最終驗證拆分工藝的成功，本研究首先分別建立了30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脫組分的HPLC色譜條件，進而分別采用三種不同的色譜條件，在HPLC-PDA與HPLC-ELSD的檢測器下，驗證各拆分組分的互不交叉性。

圖1 HPLC疊加圖

注：A.水煎總提物，B.30%乙醇洗脫組分，C.50%乙醇洗脫組分，D.80%乙醇洗脫組分

2.5.2.1 桑白皮各拆分組分HPLC色譜條件的建立 1)HPLC-PDA色譜條件：色譜柱：PLATISIL(TM)ODS C185 μm，250 mm×4.6 mm；流動相梯度洗脫條件見表2；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm。

2)蒸發光檢測器(ELSD)：色譜柱：菲羅門Synergi Fusion-RP色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相梯度洗脫程序見表2；流速：1 mL/min,；柱溫：30 ℃；增益：10；數據率：10；漂移管溫度：60 ℃；氣體壓力：40 psi；噴霧器模式為加熱，其動力水平為36%。

表2 各拆分組分HPLC流動相梯度洗脫程序

2.5.2.2 采用HPLC-PDA色譜法對桑白皮各拆分組分互不交叉性研究 分別以30%，50%，80%乙醇洗脫組分HPLC色譜條件驗證各拆分組分的互不交叉性(見表2)。采用30%乙醇洗脫條件時，50%、80%乙醇洗脫組分在0—65 min之間基本無相應的色譜峰出現；在50%乙醇洗脫條件下分析，30%、80%乙醇洗脫組分在45—75 min之間基本無相應的色譜峰出現；采用80%乙醇洗脫條件時，30%、50%乙醇洗脫組分在34—65 min之間基本無相應的色譜峰出現。結果顯示，采用PDA檢測器，在不同的流動相下對3種拆分組分反復比對，結果顯示采用不同的流動相各拆分組分保留時間基本無交叉，見圖2-圖4。

圖2 各拆分組分HPLC-PDA色譜圖(30%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

圖3 各拆分組分HPLC-PDA色譜圖(50%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

2.5.2.3 采用HPLC-ELSD色譜法對桑白皮各拆分組分互不交叉性研究 同“2.5.2.2”項下分析方法。對紫外下沒有吸收的成分，采用HPLC-ELSD色譜法進行了互不交叉研究，從HPLC-ELSD色譜圖中可以看到各拆分組分化學成分無明顯交叉，見圖5-圖7。

圖4 各拆分組分HPLC-PDA色譜圖(80%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

圖5 各拆分組分HPLC-ELSD色譜圖(30%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

圖6 各拆分組分HPLC-ELSD色譜圖(50%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

圖7 各拆分組分HPLC-ELSD色譜圖(80%乙醇洗脫組分流動相)

注：A:桑白皮30%乙醇洗脫組分;B:桑白皮50%乙醇洗脫組分;C：桑白皮80%乙醇洗脫組分

2.6 桑白皮化學拆分工藝穩定性研究 為了確保桑白皮拆分工藝的穩定性與重現性，本研究對桑白皮各化學拆分工藝穩定性進行了研究：取桑白皮藥材約5kg，分為10批，每批500 g，按照“2.1”項下的拆分方法制備得到10批次各拆分組分，通過HPLC-PDA特征圖譜研究，進行相似度評價，從而確定工藝的穩定性。

相似度評價：按照按“2.1”項下得到的10批各拆分組分的供試品溶液，根據各自色譜條件進樣，所得特征譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，相似度0.90以上，說明該拆分工藝穩定，重現性好，適用于制備各拆分組分。

2.7 化學計量學分析 將“2.6”項下制備的10批樣品進行編號：30%乙醇洗脫組分1-10，50%乙醇洗脫組分11-20，80%乙醇洗脫組分21-30。按照“2.5.2.1”項下條件進行HPLC-PDA與HPLC-ELSD分析，所得數據導入ChemPattern軟件進行多元統計分析

2.7.1 主成分分析 本實驗獲得的3個主成分。由3D散點圖(見圖8，圖9)，可直觀地看出，在兩種檢測器下，3個主成分將原始組分分為不同的3類，聚在空間不同的位置：30%乙醇洗脫組分位于PC1零點附近，50%乙醇洗脫組分位于PC2正軸附近，80%乙醇洗脫組位于PC3正軸附近。

圖8 桑白皮HPLC-PDA色譜數據主成分分析結果

圖9 桑白皮HPLC-ELSD色譜數據主成分分析結果

圖10 桑白皮各化學拆分組分HPLC-PDA聚類分析樹狀圖

2.7.2 聚類分析 采用歐氏距離法計算樣品間相似度，選用最短距離法進行聚類。根據桑白皮3個拆分組分的拆分方法，將最佳方案的30個組分聚為3類，見圖10，11，樣本1～10號為一類、11～20號為一類、21～30號為一類。驗證了30%、50%、80%乙醇洗脫組分各聚一類，互不交叉。

圖11 桑白皮各化學拆分組分HPLC-ELSD聚類分析樹狀圖

3 討論

匡海學教授研究顯示，中藥性味的物質基礎是可拆分的，而拆分組分的功效對應相應的物質基礎[6]，各拆分組分之間化學成分要求基本上為互不交叉，才能為后續的中藥性味功效的藥理實驗奠定基礎。中藥桑白皮為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮，主要功效為：瀉肺平喘，利水消腫。臨床應用廣泛，其化學成分類型主要為黃酮、二苯乙烯、多糖等[7-9]。桑白皮化學拆分組分的工藝建立原則是對桑白皮全部化學成分進行拆分，并且盡可能的避免成分的交叉，為后續的藥理實驗提供基礎。

本研究初次構想用聚酰胺色譜柱來富集黃酮類化合物[10-11]，但黃酮類化合物與二苯乙烯類化合物結構相似很難將黃酮類化合物單獨富集出來。另外，根據預實驗發現桑白皮水煎液濃縮上聚酰胺樹脂會有死吸附，很多物質用70%丙酮溶液也難以將其洗脫下來，這樣就達不到全成分拆分的效果，此拆分方法不適合中藥藥性拆分研究，故采用水煎煮提取法結合萃取、醇沉、大孔吸附樹脂等技術，將桑白皮水煎液拆分為成分之間互不交叉的以下5個組分：脂肪油組分、醇沉組分、30%乙醇洗脫組分、50%乙醇洗脫組分、80%乙醇洗脫組分。脂肪油組分通過GC-MS分析桑白皮脂肪油成分分離檢測出38個組分，含量最為豐富的物質為角鯊烷，占50.40%，其次為α-香樹脂素(10.86%)、亞油酸甲酯(9.33%)、β-香樹脂素(4.84%)、棕櫚酸甲酯(3.08%)、油酸甲酯(1.76%)等[12]。

本研究采用PDA與ELSD兩種檢測器、不同洗脫條件來驗證桑白皮化學組分拆分的互不交叉性，用ChemPattern軟件將所得HPLC-PDA及HPLC-ELSD數據進行處理，對10個批次的桑白皮30%乙

醇洗脫組分，50%乙醇洗脫組分、以及80%乙醇洗脫組分進行了化學計量學分析[13]，通過聚類分析與主成分分析確認30%、50%、80%乙醇洗脫組分各聚一類，進一步驗證了桑白皮化學拆分組分的互不交叉。

綜上所述，本研究建立了桑白皮化學成分拆分工藝以及各拆分部位HPLC色譜條件，確定了桑白皮各拆分組分的互不交叉性，為后期的各拆分組分的藥理學評價奠定了基礎。

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(2015-12-09收稿 責任編輯：洪志強)

Splitted Fractions and Unoverlapping Analysis of Chemical Constituents of Cortex Mori

Wang Xiaolan1,2，Wang Shen1,2，Zhao Wei1,2，Zhang Yanli1,2，Zhang Minghui1,2，Kuang Haixue3，Feng Weisheng1,2，Zheng Xiaoke1,2

(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China; 2TheinnovationcenterofHenanprovinceforthediagnosisandtreatmentofrespiratorydiseases,Zhengzhou450046,China; 3HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Haerbin150040,China)

Objective:Toestablished the split method of nature and flavor material foudition of Cortex Mori，analysis of Cortex Mori chemical characteristics of the split components by HPLC，validae the unoverlapping analysis of Chemical Constituents of Cortex Mori in chemometrics methods.Methods:Established Cortex Mori chemical composition of the split method by steam distillation，extraction，alcohol，macroporous adsorption resin technology.With the combined applications of steam distillation，water extraction and alcohol precipitation，liquid-liquid extraction and column chromatography over macroporous resin，thesplitted-fractions method of the chemical constituents of poriacocos was established; Unoverlapping Analysis of Chemical Constituents of Cortex Mori by combining the HPLC-PDA and HPLC-ELSD in ChemPatternclustering analysis and principal component analysis.Results:We splitted the material basis of decoction of Cortex Mori for 5 groups，each group compositions substantially free of chemical components intersect.The process is stable and controllable by 10 batch in similarity evaluation.Conclusion:The split technology of nature and flavor material foundation of Cortex Mori is stable and practical，Indicated that Cortex Mori resolvability constituent holo-composition which was detached uncross as each one could be well separated under no supervision mode.

Cortex Mori；Chemical split fraction；Unoverlapping Analysis

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目：《宣瀉利水中藥的藥性研究》(編號：2013CB531802)

王小蘭，女，助理研究員，藥物化學專業

鄭曉珂，女，博士，教授，博士生導師，E-mail:zhengxk.2006@163.com，Tel:(0371)65680011

R932

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.006