茯苓對脾虛水濕內停大鼠的健脾利水藥效物質研究

李 斌 冉小庫 孫云超 竇德強

(遼寧中醫藥大學藥學院，大連，116600)

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茯苓對脾虛水濕內停大鼠的健脾利水藥效物質研究

李 斌 冉小庫 孫云超 竇德強

(遼寧中醫藥大學藥學院，大連，116600)

目的：研究茯苓對脾虛水濕內停大鼠健脾利水的藥效物質，并探討其可能的作用機制。方法：采用優化后的飲食不節結合勞倦過度法，造成動物脾虛模型，進而腹腔水負荷生理鹽水建立脾虛水濕內停模型。以肛溫、體重、表觀指標及尿液中D-木糖排出量作為大鼠脾虛造模期的評價指標。以糞便含水率、血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、水通道蛋白1、胃泌素(GAS)及腹腔水負荷造成水濕內停后的大鼠體重下降率及尿量等指標，闡明茯苓健脾利水的有效組分。結果：造模期間，大鼠體重下降，而肛溫無變化，故表明動物已造成脾虛。經篩選后確定茯苓對脾虛水濕內停大鼠健脾利水作用的最低有效劑量為7.5 g/kg。茯苓水煎液、乙酸乙酯組分和多糖組分能顯著提高脾虛后大鼠體重。除醇洗組分外茯苓其他拆分組分能顯著提高大鼠血清白蛋白水平。多糖組分能降低腎髓中水通道蛋白1的水平。茯苓乙酸乙酯組分和多糖組分能有效提高血清胃泌素水平。茯苓乙酸乙酯組分能有效提高大鼠水負荷后體重下降率，且增加尿量。結論：茯苓對脾虛水濕內停動物利水作用主要通過其利尿作用來實現。茯苓乙酸乙酯組分、石油醚組分及多糖組分應為其健脾的物質基礎，乙酸乙酯組分也為其利尿的物質基礎。因此，以三萜類為主要成分的乙酸乙酯組分和茯苓多糖可能為其“甘”味物質基礎，乙酸乙酯組分可能也為其淡味的物質基礎。

脾虛；水濕內停；茯苓；利尿；利水

中醫認為，“脾為后天之本，氣血生化之源”。脾主運化，能有效調節全身各臟腑氣血津液精的代謝，是后天維持人體生命活動的根本。脾虛證，為脾之氣血陰陽不足，運化攝納功能失職所致的證候，是多種證候的統稱。鄒澍《本草經疏》歸納“脾虛十二證，飲食勞倦，傷脾發熱，飲食不消化，屬脾氣虛；傷食必惡食，停食，為恣飲湯水或冷茶、冷酒所致。水腫屬脾氣虛，兼脾陰虛；噎膈屬氣血兩虛，由于血液衰少，而非痰氣壅逆所成”。中醫臨床中，脾虛證為較為常見的病癥，主要表現為消化和吸收功能障礙，會產生食少納呆、腹瀉、消瘦、乏力等癥狀，導致機體抵抗力下降，全身免疫功能失調。脾居中焦，為津液升降輸布的樞紐。若脾主運化功能失調，可導致水濕內停；過量運動后，陽氣不足，不能固護肌表，玄府不密，津液外泄，異常出汗[1]。

研究基于本973課題負責人匡氏提出的“中藥一味一性，一藥X味Y性(Y≤X)?！睘楹诵膬热莸闹兴幮晕犊茖W內涵假說進行設計。這個假說可進一步解釋為“藥味主要與藥物的具體功效相關，藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機體的能量代謝、物質代謝為特征的、與治療作用有關或無關的、但均可影響藥物治療作用的發揮或與副作用發生有關的一類生物學效應。并且中藥的性味是可拆分和可組合的”。本研究基于這一假說，通過茯苓對脾虛動物健脾和利水的影響闡明茯苓之“甘、淡”兩味可能的物質基礎。

茯苓為多孔菌科植物真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，性平，味甘、淡。主要功效為利水滲濕，健脾，寧心[2]。用于水腫尿少，痰飲悸眩，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠。為臨床常用利水藥。盡管茯苓作為傳統常用中藥，但其藥味卻鮮有研究。按照上述假說，前期首先對茯苓的水煎液進行組分拆分，并對各組分化學成分交叉性進行分析[3]，表明各組分之間差異度大于85%。進一步對拆分組分的化學成分進行表征，表明茯苓石油醚組分(PEF)、主要為單萜和倍半萜，乙酸乙酯組分(EAF)主要為三萜，樹脂水洗組分(AEF)主要為小分子糖，樹脂醇洗組分(AEF)主要為吲哚乙醇及氨基酸和多糖組分(CEF)主要為大分子組成的多糖。本研究以脾虛水濕內停大鼠為研究對象，對茯苓利水功效藥效組分進行研究，并初步探討了藥效組分的可能作用機制，為其性味組分歸屬奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠，體重180～220 g，雄性，6～8周齡，由遼寧長生生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.1.2 藥物與試劑 肥豬肉(購于大商新瑪特超市)；甘藍(購于大商新瑪特超市)；氫氯噻嗪片(山西云鵬制藥有限公司；批號A130702)；生理鹽水(吉林省都邦藥業股份有限公司，批號1405180511)；考馬斯亮藍(南京建成生物工程研究所，批號20140820)；白蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20140805)；總膽固醇試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20130116)；高密度脂蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20130718)；低密度值蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20130723)；D-木糖試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20140827)；D-木糖(國藥集團化學試劑有限公司，批號20131121)；水通道蛋白1 Elisa測試盒(北京誠林生物科技有限公司，批號：201408)；GAS Elisa測試盒(北京誠林生物科技有限公司，批號：201410)。

1.1.3 實驗儀器 FA-1004電子天平(上海精科天平廠)；KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDZ4-WS低速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；UV-2100紫外分光光度計(上海UNICO公司)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)；SUNRISE型酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.1.4 主要試劑配制 1)肥豬油的制備：將肥豬肉切成小塊后，放置于100 ℃的純凈水中蒸煮，不斷翻炒，至豬油煉出，放涼后，于-20 ℃冰箱中保存。使用時取出，加熱使之溶解。

2)茯苓水煎液制備：稱取茯苓生藥450 g，10倍量水充分浸泡1 h，煎煮2 h，過濾，加10倍量水煎煮1 h，過濾，趁熱抽慮，濃縮為3.0 g/mL的茯苓水煎液，4 ℃保存備用。

3)茯苓各拆分組分的配制：茯苓拆分組分制備見文獻[3]。取茯苓各拆分組分凍干粉末適量，加入0.5%CMC-Na溶解。各組分收率如表1所示。

表1 茯苓各組分收率及給藥溶液濃度

1.2 實驗方法

1.2.1 脾虛模型大鼠制備 脾虛模型參照文獻[4]。單日喂食甘藍，雙日灌胃豬油1.5 mL/100 g。每日游泳造成力竭，大鼠口鼻沒入水中，四肢及尾巴擺動緩慢，口鼻一次性冒泡5個為止。正常組正常喂食，不游泳。模型組每只大鼠給予4 g/只鼠糧。

1.2.2 分組及給藥

1.2.2.1 茯苓水煎液不同劑量實驗 隨機選取10只正常大鼠作為正常組，隨機造模動物60只，按照文獻[5]經表觀指標評價選取合格動物，分為5組，每組10只，分別為模型組、利水陽性藥組、茯苓低、中、高劑量組。正常組大鼠每天給予10 g/只鼠糧，其余各組大鼠每天給予4 g/只鼠糧，并不再喂食甘藍和豬油，以維持模型動物癥狀的穩定性。正常組：灌胃給純凈水1 mL/100 g；模型組：灌胃給純凈水1 mL/100 g；利水陽性藥組：灌胃劑量為1 mg/100 g氫氯噻嗪；茯苓水煎液低劑量組：灌胃劑量為1.5 g/kg生藥；茯苓水煎液中劑量組：灌胃劑量為7.5 g/kg生藥；茯苓水煎液高劑量組：灌胃劑量為15 g/kg生藥。以上各組均每天給藥1次，1 mL/100 g，連續7d。

1.2.2.2 茯苓拆分組分實驗 隨機選取10只正常大鼠作為正常組，隨機造模動物90只，同上選取合格動物，分為8組，每組10只，分別為模型組、利水陽性藥組、茯苓各拆分組分組。正常組：灌胃給純凈水1 mL/100 g；模型組：灌胃給純凈水1 mL/100 g；利水陽性藥組：灌胃劑量為1 mg/100 g氫氯噻嗪；茯苓水煎液組：灌胃劑量為7.5 g/kg生藥；茯苓水洗組分組：灌胃劑量為0.1268 g/kg；茯苓醇洗組分組：灌胃劑量為0.021 g/kg；茯苓石油醚組分組：灌胃劑量為0.0015 g/kg；茯苓乙酸乙酯組分組：灌胃劑量為0.00675 g/kg；茯苓多糖組分組：灌胃劑量為0.0495 g/kg。以上各組均每天給藥1次，1 mL/100 g，連續7d。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 造模期間指標 造模期間，第1、4、7、10、14天對大鼠測定體重及肛溫。

1.2.3.2 給藥后測定指標 1)稱定給藥前后大鼠體重。

2)尿d-木糖排出量檢測。禁食12 h后用3%D-木糖灌胃，2 mL/100 g，收集5 h尿液，然后按D-木糖試劑盒說明書進行測試[6]。

3)測定糞便含水率。參照文獻的方法，收集大鼠糞便后，于80 ℃烘箱內干燥24 h，取出放涼，測干質量。測定后，放入80 ℃烘箱內干燥1 h，取出稱重。兩次重量差值不大于3 mg，即認為重量恒定[7]。

糞便含水率(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%

4)水負荷實驗。各組大鼠禁食12 h，稱量體重，作為正常對照值，然后每只大鼠腹腔注射10%體重的生理鹽水，水負荷后分別稱量0時、1時、2時、4時、6時體重及6 h尿量，期間禁食、禁水。計算每個時間點體重下降值。并同時測定排尿量[8]。

5)血生化指標檢測。各組大鼠不禁水禁食12 h，動物眼靜脈叢取血，3000 r/min，離心15 min，吸取上清，按試劑盒說明書進行測試，測定總蛋白，白蛋白，總膽固醇，HDL-C，LDL-C。

6)AQP1檢測。腎髓制備組織勻漿，按照1：9加入PBS，于組織勻漿機制作勻漿，3000 r/min離心20 min，吸取上清液，-20 ℃保存，待測AQP1，按照試劑盒說明書操作步驟測定腎髓水通道蛋白1。

7)血清GAS測定。各組大鼠禁食不禁水12 h，動物眼靜脈叢取血，3000 r/min，離心15 min，吸取上清，測定血清GAS。按照試劑盒說明書操作步驟測定。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料用均數±標準差表示，單因素方差分析進行比較。檢測同時滿足正態性和方差齊性，用LSD檢驗；檢測不同時滿足正態性和方差齊性，用Dunnett T3檢驗。除特殊說明，均采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 不同劑量組測定指標

2.1.1 造模期間模型體重及肛溫的測定 造模第1天模型組與正常組體重無明顯差異，造模第4天時模型組體重明顯下降，隨著造模時間的延長模型組大鼠體重顯著降低，第4、7、10、14天大鼠體重均與正常組有統計學意義(P<0.01)；但在造模期間大鼠的肛溫無明顯變化(見圖1及圖2)。

圖1 造模期間體重變化(g) 圖2造模期間肛溫變化(℃)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01(CG空白組；MG模型組)

2.1.2 總體體征的變化 模型組大鼠從第3天開始，游泳耐力下降，表現出逐漸消瘦，糞便時干時軟，偶爾便溏，后期食量攝入量減少，飲水量減少。表現出消瘦，懶動，倦怠，蜷縮聚堆，瞇眼及弓背等。

2.1.3 給藥前后體重變化 給藥前、給藥后各組大鼠體重均極顯著低于正常組(P<0.01)，與模型組相比較，給藥后大鼠體重，茯苓低、高劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)，茯苓中劑量組有統計學意義(P<0.05)，與空白組相比，給藥前、給藥后各組大鼠體重均極顯著低于空白組(P<0.01)，給藥后茯苓各劑量組和陽性藥組大鼠體重變化不大。(見圖3)。

圖3 各組大鼠給藥前后體重測定(g)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.1.4 尿中D-木糖排出量測定 D-木糖的吸收代謝情況是可以反映機體胃腸吸收排泄功能的強弱，D-木糖含量的降低是評判脾虛的重要指標。與正常組相比，各組大鼠尿液中排出D-木糖含量較低，有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，茯苓各給藥組略有升高。(見圖4)。

圖4 各組大鼠尿D-木糖排出量測定(mg)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.1.5 糞便含水率測定 糞便含水率與正常組相比，模型組、茯苓中劑量組、茯苓高劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，陽性藥組有統計學意義(P<0.01)。(見圖5)。

圖5 各組大鼠糞便含水率測定(%)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.1.6 水負荷實驗測定 給予生理鹽水負荷后，模型組的水液代謝能力明顯低于正常組(P<0.01)，茯苓各劑量組較模型組均有統計學意義(P<0.01)。茯苓在2 h后呈現出較強的代謝能力。(見表2及表3)。

大鼠在0～2 h排尿量，與正常組相比，模型組、茯苓低、高劑量組有均有統計學意義(P<0.01)，與模型組相比，茯苓中劑量組，陽性藥組有統計學意義(P<0.01)；大鼠在2～4 h排尿量，與正常組相比，模型組有統計學意義(P<0.01)，茯苓低、高劑量組有統計學意義(P<0.05)，與模型組相比，茯苓低、高劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)；大鼠在4～6 h排尿量，與正常組相比，模型組、茯苓低劑量組有均有統計學意義(P<0.01)，茯苓中、高劑量組有統計學意義(P<0.05)；6 h總共的尿量，與正常組相比，模型組、茯苓各劑量組有均有統計學意義(P<0.01)，與模型組相比，茯苓中劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)，茯苓低、高劑量組有統計學意義(P<0.05)。(見圖6)。

圖6 各組大鼠排尿量測定(mL)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.1.7 血生化指標檢測 生化指標可反應出機體對營養物質的吸收利用情況?？偟鞍捉档统Ｒ娪跔I養及吸收障礙，白蛋白更是作為臨床診斷水腫的重要指標，白蛋白降低是水腫發生的直接指標?？偰懝檀计溲鍧舛瓤勺鳛橹x的指標，總膽固醇增高會誘發機體發生各種疾病。高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)都屬于載脂蛋白，是血脂在血液內轉運的一種形式，高密度脂蛋白(HDL)的功能是逆向轉運膽固醇，是將脂類由外周轉運至肝臟分解代謝。低密度脂蛋白(LDL)的功能是轉運內源性膽固醇，是將脂類由肝臟向外周轉運?？偟鞍缀靠瞻捉M高于其他各組，與空白組相比，模型組、茯苓低、高劑量組有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比茯苓各劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)。白蛋白含量，與空白組相比，模型組、陽性藥組、茯苓低劑量組有統計學意義(P<0.01)；與模型組比，各組均有統計學意義(P<0.01)?？偰懝檀己蚅DL-C含量，與空白組比，茯苓高劑量組有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，茯苓各劑量組和陽性藥組有統計學意義(P<0.01)。HDL-C含量，與空白組相比模型組有統計學意義(P<0.01)，茯苓高劑量組有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，茯苓各劑量組和陽性藥組有統計學意義(P<0.01)。(見圖7)。

圖7 各組大鼠血生化指標測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.1.8 腎髓水通道蛋白1水平測定 AQP1主要表達于腎近曲小管和亨利袢降支的頂質膜與側膜上，主要參與原尿中水分的重吸收。體外實驗表明，AQP1降低導致近曲小管和亨利袢降支細段的滲透性及重吸收能力降低，逆流倍增系統遭破壞，表現為多尿。因此，AQP1水平升高的大鼠可出現尿液濃縮功能增強，表現為少尿。與正常相比，茯苓低、中劑量組、陽性藥組有統計學意義(P<0.01)，模型組、茯苓高劑量組有統計學意義(P<0.05)(見圖8)。

圖8 各組大鼠腎髓中水通道蛋白1水平測定(μg/L)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；LG茯苓低劑量組；ZG茯苓中劑量組；HG茯苓高劑量組)

2.2 拆分組分組測定指標

2.2.1 拆分組分組模型體重及肛溫的測定 造模第1天模型組與正常組體重無明顯差異，造模第4天時模型組體重明顯下降，隨著造模時間的延長模型組大鼠體重顯著降低，第4、7、10、14天大鼠體重均與正常組有統計學意義(P<0.01)；但在造模期間大鼠的肛溫無明顯變化(見圖9及圖10)。

圖9 造模期間體重變化(g) 圖10 造模期間肛溫變化(℃)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01(CG空白組；MG模型組)

圖11 各組大鼠給藥前后體重測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組;1給藥前;2給藥后)

2.2.2 總體體征的變化 模型組大鼠從第3天開始，游泳耐力下降，表現出逐漸消瘦，糞便時干時軟，偶爾便溏，后期食量攝入量減少，飲水量減少。表現出消瘦，懶動，倦怠，蜷縮聚堆，瞇眼及弓背等。

2.2.3 給藥前后體重變化 與正常組相比，給藥前、給藥后各組大鼠體重均極顯著低于空白組(P<0.01)，與模型組比，給藥前茯苓各組分組無統計學意義，給藥后茯苓水煎液組、茯苓多糖組體重增高(P<0.05)，茯苓乙酸乙酯組體重下降(P<0.01)，其余茯苓各組分組大鼠體重變化不顯著。(見圖11)。

2.2.4 尿D-木糖排出量測定 與正常組相比，模型組與茯苓各組尿液中D-木糖含量有統計學意義(P<0.01)。(見圖12)。

圖12 各組大鼠尿D-木糖排出量測定(mg)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

2.2.5 糞便含水率測定 與正常組相比，模型組、茯苓水煎液組、茯苓水洗組糞便含水量有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，茯苓乙酸乙酯組含水量降低且有統計學意義(P<0.05)茯苓多糖組含水量降低且有統計學意義(P<0.01)。(見圖13)。

圖13 各組大鼠糞便含水率測定(%)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

2.2.6 水負荷實驗結果 大鼠在0～1 h體重下降率，與正常組相比，模型組有統計學意義(P<0.01)，正常動物給藥組組、茯苓水洗組、茯苓醇洗組有統計學意義(P<0.01)；大鼠在1～2 h體重下降值，與正常組相比，模型組、茯苓水煎液組、茯苓水洗組、茯苓醇洗組、茯苓石油組、茯苓多糖組有統計學意義(P<0.05)；大鼠在2～4 h體重下降率，與空白組相比，模型組有統計學意義(P<0.01)，茯苓水洗組、茯苓石油醚組有統計學意義(P<0.05)；大鼠在4～6 h體重下降率，未見差異；6 h總下降率，與正常組相比，模型組、茯苓各組分組組有均有統計學意義(P<0.01)，與模型組相比，茯苓水煎液組、茯苓乙酸乙酯組有統計學意義(P<0.05)。(見表4及表5)。

6 h總尿量，與空白組相比，模型組、茯苓各組分組組有均有統計學意義(P<0.01)，與模型組相比，茯苓水煎液組、茯苓乙酸乙酯組明顯升高且有統計學意義。(見圖14)。

圖14 各組大鼠排尿量測定(ml)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組;MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

圖15 各組大鼠血生化指標測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組;MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

2.2.7 血生化指標檢測 總蛋白含量，與正常組相比，模型組、茯苓各組分組均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比，茯苓各組分均未見差異。白蛋白含量，與空白組相比，模型組、茯苓各組分組均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比，茯苓水煎液組、茯苓水洗組、茯苓石油醚組、茯苓乙酸乙酯組有統計學意義(P<0.01)，茯苓多糖組有統計學意義(P<0.05)。(見圖15)。

表2 各組大鼠水負荷后體重下降值的測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01;*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01。采用Dunnett T3檢驗。

表3 各組大鼠水負荷后單位體重下降率測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01。采用Dunnett T3檢驗。

表4 各組大鼠水負荷后體重下降值測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01。采用Dunnett T3檢驗。

表5 各組大鼠水負荷后單位體重下降率測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01。采用Dunnett T3檢驗。

2.2.8 腎髓水通道蛋白1水平測定 與正常組相比，模型組、茯苓各組分組有統計學意義(P<0.01)；與模型組比，茯苓茯苓多糖組顯著降低(P<0.05)。(見圖16)。

圖16 各組大鼠腎髓水通道蛋白1水平測定

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

2.2.9 血清GAS測定 GAS是胃腸道主要激素之一，由G細胞分泌，以胃竇部最多，其次是胃底、十二指腸和空腸等處。GAS的生理功能主要為刺激胃酸的分泌，促進胃黏膜和壁細胞的生長以及胃腸道的蠕動。GAS的降低表明胃腸功能的代謝減緩。GAS含量，與正常組相比，模型組、茯苓各組分組均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比，茯苓水煎液組、茯苓乙酸乙酯組、茯苓多糖組有統計學意義(P<0.01)(見圖17)。

圖17 各組大鼠血清GAS測定(μg/L)

注：△表示與空白組相比，P<0.05；△△表示與空白組相比，P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01(CG空白組；MG模型組；QG陽性藥組；MDG茯苓水煎液組；WEF茯苓水洗組；AEF茯苓醇洗組；PEF茯苓石油醚組；EAF茯苓乙酸乙酯組；CEF茯苓多糖組)

3 討論

根據中醫脾虛水濕內盛的相關理論，脾虛可造成機體內水濕停滯，即體內水液代謝發生異常[9]。人體的水液有四大排出途徑，即呼吸、汗液、小便、大便而排出體外。其中任何一種代謝方式受到影響，都勢必會造成機體內環境的紊亂，而導致水濕內盛。由于脾在水液的上下布散運動中發揮著樞紐作用，因此脾運化水液的功能減退，必然導致水液在體內停聚而產生水、濕、痰、飲等病理產物，甚至導致水腫[10-11]。

在本實驗研究中，主要通過藥理實驗，探究茯苓不同劑量及其拆分組分對脾虛水濕內停大鼠的治療作用，進而明確茯苓利水滲濕的藥效物質基礎。

脾虛水濕內停動物模型的造模方法是首先采用勞倦加飲食失節法造成動物脾虛，然后觀查脾虛動物對腹腔水負荷后的脾虛水濕內停動物的水代謝的影響。

我們首先對茯苓不同劑量進行考察，造模前各組大鼠體重無明顯差異，但隨著造模時間的延長，體重明顯下降，且有統計學意義。而肛溫在整個過程中均無明顯變化，無統計學意義。說明模型大鼠表現出的癥狀應是脾氣虛，而不是陽虛或陰虛。水負荷實驗中，模型組表現出明顯的水液代謝障礙。給予茯苓水煎液后，體重值及單位體重下降率出現明顯的增高。說明茯苓有較強的利水作用，且以中劑量組為最佳。D-木糖的吸收代謝情況是可以反映機體吸收功能的強弱，D-木糖含量的降低是評判脾虛的重要指標[12]。模型組大鼠尿量中D-木糖含量顯著低于空白組，和模型組相比，茯苓中劑量水煎液可以有效改善脾虛水濕內停動物模型的脾虛狀態，提高其相應的消化吸收功能。對大鼠進行腹腔水負荷后，可看出空白組排尿能力較正常，模型大鼠體現出明顯的排尿障礙，而茯苓各給藥組的尿量明顯增加，說明茯苓的水液代謝途徑是通過尿液排出。

總蛋白、白蛋白、HDL-C的含量模型組均低于正常組，總膽固醇，LDL-C的含量模型組均高于正常組，這都說明脾虛運化失司，水谷精微生化乏源，水液運化障礙。中劑量茯苓均能有效改善這些指標。茯苓各劑量組糞便含水量明顯低于模型組，可認為茯苓的排水途徑不可能是由糞便排出。茯苓水煎液可以為脾虛水濕內停動物模型的有效健脾燥濕最低有效劑量。

AQP1位于腎臟近曲小管及亨利袢降支的頂質膜與側膜上，主要介導原尿中水分的重吸收。離體實驗證明，AQP1降低導致近曲小管和亨利袢降支細段的滲透性及重吸收能力降低，逆流倍增系統遭破壞，表現為多尿。因此，AQP1水平升高的大鼠可出現尿液濃縮功能增強，表現為少尿[13-14]。茯苓各劑量組體現出明顯升高大鼠腎髓中水通道蛋白1的作用。說明茯苓對水的調節作用不通過AQP1實現。

其后，對茯苓拆分組分進行研究。D-木糖的吸收情況是可以反映機體吸收功能的強弱，D-木糖的降低是評判脾虛的重要指標。茯苓水煎液升高D-木糖含量。而各組分未見升高，僅多糖組有此趨勢。茯苓水煎液、茯苓乙酸乙酯組尿量升高，且糞便含水量明顯降低說明茯苓的水液代謝途徑是由尿液排出。因此，茯苓利水滲濕的有效組分是乙酸乙酯組分?？偟鞍字饕从硻C體對營養物質的吸收功能，白蛋白主要為判斷體內水濕與否的重要指標[15]。從總蛋白和白蛋白的含量上，也可看出，茯苓水洗、多糖組含量均有升高，而茯苓乙酸乙酯組僅升高白蛋白含量。

GAS是胃腸道主要激素之一，由G細胞分泌，以胃竇部最多，其次是胃底、十二指腸和空腸等處。GAS的生理功能主要為刺激胃酸的分泌，促進胃黏膜和壁細胞的生長以及胃腸道的蠕動。據實驗報道，健脾除濕藥或燥濕化濕藥有提高脾虛動物血清GAS的作用[16]。由此可知，中醫運用健脾除濕藥和除濕化濕藥治療脾虛證而獲效的機理，可能即與提高脾虛患者血清GAS含量，從而刺激胃酸、胃蛋白酶和胰酶的分泌，促進胃竇的收縮有關。模型組與正常組比較GAS含量明顯降低，與現代醫學認為的脾虛與胃泌素分泌減少有關相一致，脾氣不足則氣推動乏力，胃腸運動減慢[17]。茯苓乙酸乙酯組、茯苓多糖組GAS顯著升高，綜上可說明，茯苓對脾虛水濕內停動物利水作用主要通過其利尿作用來實現。茯苓乙酸乙酯組分、石油醚組分及多糖組分應為其健脾的物質基礎，乙酸乙酯組分也為其利尿的物質基礎。因此，以三萜類為主要成分的乙酸乙酯組分和茯苓多糖可能為其“甘”味物質基礎，乙酸乙酯組分可能為其其淡味的物質基礎。

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(2015-12-09收稿 責任編輯：洪志強)

The effective substances of Fuling on the invigorating spleen and promoting the water metabolism in the rat model with the water and dampness retention caused by spleen deficiency

Li Bin，Ran Xiaoku，Sun Yuncao，Dou Deqiang

(Collegeofpharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China)

Objective:To explore the effect of Fuling for invigorating spleen and promoting the water metabolism in the rat model with the water and dampness retention caused by spleen deficiency so as to explore its effective substances.Methods:The optimized methods of improper diet and overstrain were used to replicate spleen-deficiency model.The rats with spleen deficiency were further administered intraperitoneal (i.p.) water to prepare the cohesion model of water and dampness.The changes of the rectal temperature，weight，the apparent situation and concentration of D-xylose in urine of rats was used to evaluate the spleen deficiency animal model.The water ratio of faeces，the TP，ALB，TC，HDL-C and LDL-C in serum，AQP1 in the renal medullary part and GAS as the main indexes in the spleen deficiency model with cohesion of water and dampness to elucidate the effective fraction of Fuling.Results:During the period of model preparation,the rats weight was decreased and no change was observed in rectal temperature，indicating that spleen deficiency of rats has been formed.The 7.5 g/kg dose of the water decoction of Fuling was tested as effective dosage.The water decoction，ethyl acetate fraction (EAF) and crude polysaccharide fraction (CPF) could obviously increase the weight of rats with spleen deficiency.Except alcohol eluate fraction (AEF)，the other fractions of Fuling could increase the level of ALB in serum of rats with spleen deficiency significantly.CPF could decrease the level of AQP1 in renal medullary part of rats with spleen deficiency.EAF and CPF could promote the GAS level in serum of rats with spleen deficiency.EAF could increase the loss rates of body weight and the volume of urine of spleen deficiency rats with cohesion of water and dampness.Conclusion:The promoting action of Fuling on water metabolism is mainly via its diuretic function.EAF and CPF are the effective fractions of Fuling for invigorating spleen and EAF is also the effective fraction of Fuling for removing dampness.Consequently，the EAF mainly composed of triterpenoids and CPF might be the effective substances for the sweet flavor of Fuling and EAF might be the effective substances for the pale flavor of Fuling.

Spleen deficiency; Water and dampness retention; Fuling; Diuretic

國家重點基礎研究計劃(973計劃)項目(編號：2013CB531803)；遼寧省高等學校創新團隊課題(編號：LT2013020)資助項目

竇德強，教授，Tel：+86(411)85890186，Fax：+86(411)05890128，E-mail：deqiangdou@126.com

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A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.007