傅靜娟 羅會盛 卞 勇 朱子寒 歐 寧
(1 南京中醫藥大學附屬醫院;2 南京中醫藥大學;3 江蘇省人民醫院,南京,210029)
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乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生作用機制研究
傅靜娟1羅會盛1卞 勇2朱子寒3歐 寧3
(1 南京中醫藥大學附屬醫院;2 南京中醫藥大學;3 江蘇省人民醫院,南京,210029)
目的:研究乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生組織中血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)與增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表達的影響。方法:56只雌性大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、賦形劑對照組、乳增寧組、乳安凝膠膏4.16 g/kg、2.08 g/kg、1.04 g/kg劑量組,共7組,采用注射苯甲酸雌二醇、黃體酮造模,給藥30 d。免疫組化法測定各組大鼠乳腺組織PCNA和VEGF的表達。結果:乳安凝膠膏劑4.16 g/kg、2.08 g/kg組能降低大鼠乳腺PCNA和VEGF的表達,與模型組比較,差異均有統計學意義(P<0.05,0.01)。結論:乳安凝膠膏劑可通過抑制其乳腺血管內皮生長因子和增殖細胞核抗原的表達活性,達到對抗大鼠乳腺增生的目的。
乳安凝膠膏劑;乳腺增生;PCNA;VEGF
乳安凝膠膏劑是由臨床上使用多年、療效確切的江蘇省中醫院驗方改制而成,主要用于乳腺增生病的治療。本文主要通過觀察乳安凝膠膏劑對乳腺增生大鼠乳腺組織中的PCNA與VEGF表達的影響,探討其治療乳腺增生病的作用機制,為臨床應用提供依據[1]。
1.1 實驗動物 56只SD大鼠,雌性,健康未孕,體重(220±20)g,北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2012-0001。
1.2 受試藥物 乳安凝膠膏由南京中醫藥大學第一附屬醫院藥學部制備,藥物組成:淫羊藿、延胡索、丁香、肉桂;藥物制備:淫羊藿水提,延胡索醇提,丁香肉桂提取揮發油,將上述提取物與氮酮加入空白凝膠膏料中攪勻,用層壓法將膏藥與保護層(聚乙烯薄膜)復合成制成乳安凝膠膏,晾干備用。
1.3 試劑 苯甲酸雌二醇,天津金耀氨基酸有限公司,批號:H20150510;黃體酮,天津金耀氨基酸有限公司,批號:H201505632;抗體,購自北京博奧森生物技術有限公司;SP免疫組化檢測試劑盒,購自北京博奧森生物技術有限公司;PBS緩沖液:自行配制,每升中含8 g NaCl,0.2 g KCl,1.44 g Na2HPO4,0.24 g KH2PO4,pH調至7.4。
1.4 儀器 Leica ASP300S全自動真空組織脫水機;Shandon包埋機;Shandon手動切片機;Shandon全自動染色機;OLYMPUS顯微鏡。
2.1 分組及模型建立 將大鼠隨機分為正常對照組、賦形劑對照組、乳腺增生模型組、乳增寧組、乳安凝膠膏劑大劑量組、中劑量組、小劑量組。正常組不給予任何藥物,肌內注射等體積生理鹽水,1次/d,連續25 d。其余各組大鼠肌內注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,1次/d,連續20 d,繼而改用黃體酮5 mg/kg,1次/d,連續5 d。
2.2 給藥 造模成功后,乳安凝膠膏劑大、中、小劑量組及賦形劑組每天進行乳安凝膠膏劑外貼,選取造模后大鼠最腫大的第三對乳房用藥物外貼(大劑量組給予4.16 g/kg、中劑量組2.08 g/kg、小劑量組1.04 g/kg,每24 h換藥1次,連續30 d。乳增寧組每日上午空腹按劑量定時灌胃給藥一次(給予乳增寧,0.9 g/kg,連續30 d。
2.3 檢測指標 實驗結束時,取大鼠第三對乳頭,稱重后,用10%甲醛溶液固定,經脫水浸蠟后,進行石蠟包埋、切片。步驟:1)石蠟切片常規脫蠟至水;2)PBS洗二遍,每遍5 min;3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min,蒸餾水洗1次;4)抗原修復;5)PBS洗5 min;6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫10 min;7)甩去多余液體滴加一抗4 ℃過夜(過夜后在37 ℃復溫45 min);8)PBS洗2次各5 min;9)滴加生物素化二抗,37 ℃孵育30 min;10)PBS洗2次各5 min;11)滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉菌抗生物素溶液,37 ℃孵育20 min;12)PBS洗2次各5 min;13)DAB顯色3~10 min在顯微鏡下掌握染色程度;14)蒸餾水洗終止染色,蘇木素復染;15)脫水,透明,封片,鏡檢。每張切片取5個高倍視野,用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組光密度值。
3.1 乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生組織VEGF表達的影響 見表1。模型組大鼠乳腺組織中VEGF陽性表達增加,與正常組比較,差異有統計學意義(P<0.01),乳增寧組大鼠乳腺組織VEGF表達減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05);乳安凝膠膏劑大劑量組大鼠乳腺組織中VEGF表達明顯減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。
3.2 乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生組織PCNA表達的影響 見表2。模型組大鼠乳腺組織中PCNA的陽性表達明顯增加,與正常組比較,差異有統計學意義(P<0.01),乳增寧組乳腺組織中PCNA陽性表達減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05);乳安凝膠膏劑大、中劑量組乳腺組織中PCNA陽性表達明顯減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.01,0.05)。
表1 乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生組織VEGF表達的影響
注:與正常對照組比較*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較#P<0.05,##P<0.01。
表2 乳安凝膠膏劑對大鼠乳腺增生組織PCNA表達的影響
注:與正常對照組比較*P<0.05,**P<0.01,與模型組比較#P<0.05,##P<0.01。
圖1 正常對照組VEGF表達 圖2模型對照組VEGF表達
圖3 賦形劑對照組VEGF表達 圖4乳增寧組VEGF表達
圖5 乳安凝膠膏劑大劑量組VEGF表達 圖6 乳安凝膠膏劑中劑量組VEGF表達
圖7 乳安凝膠膏劑小劑量組VEGF表達 圖8 正常對照組PCNA表達
圖9 模型對照組PCNA表達 圖10 賦形劑對照組PCNA表達
圖11 乳增寧組PCNA表達 圖12 乳安凝膠膏劑大劑量組PCNA表達
圖13 乳安凝膠膏劑中劑量組PCNA表達 圖14 乳安凝膠膏劑小劑量組PCNA表達
VEGF最初是Senger等在腫瘤細胞分泌物中發現的,具有高度的血管滲透性,是重要的血管滲透性因子,它可增加毛細血管和小靜脈等微小血管對大分子的通透性,微血管通透性的增加可引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲,外漏的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白而沉積,并通過誘導間質產生而促進體內新生血管生成[8-10]。近年來,較多學者研究發現血管生成與乳腺增生病的發生密切相關。宋愛莉[11]等對140例乳腺增生病患者進行乳房腫塊活檢,觀察病變組織的病理分型類型、分級及VEGF、bFGF的表達情況,免疫組化結果顯示,不同病理分級的VEGF,bFGF表達存在差異,從一般增生到非典型增生,VEGF、bFGF的表達逐漸增強(P<0.05)。表明隨乳腺增生程度的增加,組織血管生成因子的表達增強,兩者存在相關性。段彥蒼[12]等通過制作乳腺增生的大鼠模型,采用酶聯免疫法測定血清VEGF和bFGF含量及其在乳腺組織中的表達,發現與正常組相比,模型組大鼠血清中VEGF和bFGF含量明顯升高,在乳腺組織中表達增強。表明模型組大鼠體內存在的某些血管因子被激活后,直接或間接促進了局部乳腺組織血管的增生。
PCNA由Miyachi等于1978年首次發現并命名,一種分子量為36KD的酸性蛋白質,以后的研究發現PCNA與表達與細胞周期有關,故又稱為周期蛋白,在細胞增殖的啟動上起重要作用[13],是反映細胞增殖狀態的良好指標。PCNA的表達程度和含量是評價細胞增殖狀態的客觀指標,已證實PCNA的合成和表達與細胞的增殖狀態有關[14]。
本實驗中,模型組大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA陽性表達增加,與正常組比較,差異有統計學意義(P<0.01),可見在造模的過程中,隨著乳腺組織VEGF、PCNA表達增加,血管內皮細胞增殖增多,乳腺導管上皮的增殖活性加強,同時血管滲透性增加,引起血管中的蛋白質外滲,乳腺組織發生一系列病理性變化。乳增寧組大鼠乳腺組織VEGF、PCNA表達減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05);乳安凝膠膏劑大劑量組大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA表達明顯減少,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。表明外敷乳安凝膠膏劑后,乳腺增生大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA表達減少,差異有統計學意義。提示乳安凝膠膏劑可以通過降低VEGF的活性,抑制乳腺上皮細胞的增值,對乳腺增生起到一定的抑制作用。
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(2015-07-23收稿 責任編輯:張文婷)
Mechanism of Ru'an Ningjiao Ointment on Hyperplasia of Mammary Gland Rats
Fu Jingjuan1, Luo Shenghui1, Bian Yong2, Zhu Zihan3, Ou Ning3
(1AffiliatedHosptitaltoNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 3RenminHospitalofJiangsu,Nanjing210029,China)
Objective:To observe the mechanism of Ru'an Ningjiao ointmentm on tissue of rat vascular endothelial growth factor (PCNA) and the influence of PCNA (VEGF) expression in rats with hyperplasia of mammary gland.Methods:A total of 56 female unpregnant rats were randomly divided into 7 groups: normal control group, model group, excipient control group, Ruzengning group, Ru'an Ningjiao ointment 4.16 g/kg, 2.08 g/kg, 1.04 g/kg dose groups. Models were produced by injecting estradiol benzoate and progesterone for 30 days. Use immunohistochemical method to determine the expression of PCNA and VEGF in rats with breast hyperplasia.Results:Ru'an Ningjiao ointment 4.16 g/kg, 2.08 g/kg group can reduce the expression of PCNA and VEGF, and compared with model group, the difference had statistical significance(P<0.05, 0.01).Conclusion:Ru'an Ningjiao ointment can inhibit the mammary gland vascular endothelial growth factor and the expression of cell activity, and thus to control hyperplasia of mammary gland.
Ru'an Ningjiao ointment; Hyperplasia of mammary glands; PCNA; VEGF
江蘇省中醫藥管理局研究項目(編號:LZ09044)
傅靜娟(1982—),女,南京人,碩士,主管中藥師,研究方向:藥劑學與臨床藥學、藥理學,E-mail:xiaoyi82231@sina.com
羅會盛,副主任中藥師,E-mail:luohuisheng9@126.com
R285.5
A
10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.026