NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌組織中表達的探討

李宏謙，常永超，姜雅琳，陳夢露，李小珍，高 強

·基礎醫學·

NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌組織中表達的探討

李宏謙，常永超，姜雅琳，陳夢露，李小珍，高 強

目的 探討NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌組織中的表達情況。方法 收集在我院行胃癌根治術患者的胃癌及自身正常對照組織標本各15例，慢性胃炎患者胃鏡下活檢胃黏膜組織標本20例，采用實時定量PCR法檢測NOX2和NOX3 mRNA的表達情況。結果NOX2和NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達量顯著高于自身正常對照組織和慢性胃炎組織；NOX2 mRNA在胃癌自身正常對照組織與慢性胃炎胃黏膜組織中的表達無明顯差異；NOX3 mRNA在后兩者中的表達量均很少。結論 NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌的發生和發展過程中可能發揮重要作用。

NADPH氧化酶；NOX2；NOX3；胃癌；慢性胃炎

胃癌在我國是一種常見的惡性腫瘤，胃癌的發生發展涉及多因素和多環節。流行病學調查和病因學顯示胃癌的發病與遺傳、環境、幽門螺桿菌感染等諸多因素綜合作用有關。NADPH氧化酶家族由NOX1-5、DUOX1和DUOX2組成，這組氧化酶可以產生活性氧類 (Reactive oxygen species, ROS)[1-2]。ROS是一類氧衍生的分子，包括超氧化物、過氧化氫、羥自由基及各種脂質過氧化反應的產物，ROS可作為信號分子調節細胞的正常行為，也能夠影響細胞的有絲分裂或表型轉換，還可以誘導血管源性因子如血管內皮生長因子的分泌，最終促進腫瘤新生血管形成和腫瘤細胞增殖[3]。有研究表明，NOX可能與細胞分化相關，Geiszt等[4]發現在大腸癌細胞被誘導分化過程中NOX1表達顯著升高。NOX的異常表達和激活可以引起正常細胞的惡性轉化或凋亡壞死[5]。此外，NOX還影響某些基因的表達，在NOX1轉染的細胞中，包括調節細胞分裂或腫瘤源性相關的基因、細胞周期相關的基因、信號傳遞蛋白基因、與人類腫瘤相關的蛋白質生成或激活的蛋白基因等多個基因表達上調或下調[6]。本文通過研究胃癌組織中NOX2和NOX3基因的表達情況，探討NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2013年8月至2014年2月河南科技大學第一附屬醫院收治的行胃癌根治術的患者15例(男9例，女6例)，年齡40～65歲，平均53歲，以及同期有消化道癥狀來我院做胃鏡檢查的慢性胃炎患者20例(男10例，女10例)，年齡35～60歲，平均48歲。

1.2 標本收集 手術室取切除的胃癌組織標本與距病變組織5 cm以外的正常對照組織各1塊，預冷的PBS清洗后立即放入液氮中速凍，然后轉入-80℃冰箱保存備用，其余大體標本送病理檢查。胃鏡下取黏膜組織2塊，部位為胃竇部距幽門口2～3 cm處，其中1塊立即存放于液氮中，然后轉移到-80℃冰箱保存備用，另1塊送組織病理學檢查。

1.3 NOX2和NOX3基因表達檢測 實時熒光定量(Real time, RT) PCR檢測NOX2和NOX3 mRNA表達：取200 mg組織，放到無RNase的1.5 mL離心管中，采用Trizol(美國Invitrogene公司)法提取總RNA，用核酸定量儀測定RNA純度和濃度。取總RNA 2 μg, 按照逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。冰上配制PCR反應液，反應體系25 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Taq II (2×) 12.5 μL, DEPC水8.5 μL, 上下游引物(表1)各1 μL。在BIO-RAD RT PCR儀中進行PCR反應，反應條件為：95 ℃預變性30 s、95 ℃ 變性5 s、57 ℃(NOX2)/ 58℃(NOX3)退火30 s、72℃ 延伸30 s，共40個循環。結果以閾循環 (Ct) 值表示，每個樣本3個復孔，取平均Ct值，β-actin作為內參基因，采用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2 結果

NOX2 mRNA 在胃癌組織中的表達明顯增加(4.6±1.6)分別是正常對照組織的3.1倍(P=0.03)和慢性胃炎組織的2.5倍(P=0.01)，NOX2 mRNA在慢性胃炎與胃癌自身正常對照組織的表達無明顯差異(P>0.05)。與NOX2 mRNA 表達情況相同，NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達明顯增加 (10.0±1.9)，是胃癌自身正常對照組織和慢性胃炎胃黏膜組織的2.7倍(P<0.05)，后兩者均少量表達且兩組之間無差別。見表2。

組別nNOX2NOX3胃癌組154．6±1．610．0±1．9胃癌自身正常對照組156．2±2．311．4±1．8慢性胃炎組205．9±1．111．5±2．2

注：各組mRNA的Ct值均為減去內參β-Actin Ct值所得的ΔCt值

3 討論

本實驗采用RT-PCR方法對胃癌與自身正常對照組織及慢性胃炎組織標本中NOX2和NOX3 mRNA 進行檢測，結果顯示NOX2和NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達量明顯高于自身正常對照以及慢性胃炎組織，提示NOX2和NOX3在胃癌的發生發展過程中可能發揮重要作用。

NOX2基因位于X染色體p21.1，編碼含有570個氨基酸的NOX2蛋白。NOX2首先在中性粒細胞和吞噬細胞內被發現，這些細胞的細胞內和細胞膜均有NOX2表達，靜息狀態時NOX2定位在細胞內，不產生ROS，當受到病原微生物和細胞因子等外界刺激時，NOX2會易位到細胞的表面并被迅速激活。細胞內產生的ROS可以通過信號轉導通路激活NOX2。人類NOX3與NOX2氨基酸序列有56%的同源性[7]，NOX3在內耳高表達，在胎兒的脾、腎、顱骨和腦也有表達。在有調節亞基p47phox等存在的情況下能夠明顯增加NOX3的活性。正常情況下，NOX家族氧化酶產生的ROS能維持細胞的正常生理活動，但當機體受到外界環境中的炎癥介質、細胞因子和生長因子等刺激時[8]，就會引發NOX家族氧化酶過表達產生大量ROS，產生的大量ROS可與大多數細胞大分子發生反應，可使酶失活，引起DNA損傷，DNA異常甲基化等，從而誘發癌基因激活、抑癌基因失活、修飾翻譯后的蛋白質及脂質過氧化反應損傷細胞膜，機體多種疾病的發生都與此密切相關[7,9]。

胃癌的發生常伴有多種基因的異常表達，本實驗研究顯示NOX2和NOX3基因在胃癌組織中高表達，表明NOX2和NOX3可能在胃癌發生發展中發揮作用，過量表達的NOX2產生過多的ROS導致了DNA異常修飾從而引起DNA損傷，同時導致癌基因的激活和抑癌基因的失活，在胃癌的發展階段，過量表達的ROS通過對MAPKs、JAK-STAT、NF-КB等[10-12]信號通路的調節，促進了細胞的轉化、腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管的生成和細胞凋亡的抑制等。另一方面NOX2和NOX3產生的ROS可能增加細胞的遷移速率從而增強腫瘤細胞的侵襲能力[13-14]。這一系列的過程最終影響了胃癌的發生發展。本實驗中NOX3在慢性胃炎胃黏膜和胃癌自身正常對照組織中的表達量均很少，而在胃癌組織中的表達量大量增加，提示在胃癌的發展過程中NOX3發揮了重要作用?？傊?，胃癌的發生發展涉及多環節多階段，作者通過對NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌中表達情況的探討，使得對胃癌的發生發展有了一些更多的思考，但還有許多細胞方面的機理未完全闡明，諸如NADPH氧化酶與腫瘤轉移以及預后的關系等。NADPH氧化酶在疾病發生中的作用已得到目前眾多學者的關注和研究，新的NOX蛋白家族特異性靶點的闡明，可能為生物醫學的發展和腫瘤的臨床治療提供新的思路。

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Expression of NADPH OxidaseNOX2 andNOX3 mRNAin Human Gastric Cancer

LI Hong-qian, CHANG Yong-chao, JIANG Ya-lin,et al

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003, China)

ObjectiveTo investigate the expression of NADPH oxidaseNOX2 andNOX3 mRNA in human gastric cancer tissues.MethodsFifteen samples from radical resection of gastric cancer, 15 samples from normal control group, and 20 biopsies from chronic gastritis patients were collected from the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology.NOX2 andNOX3 mRNAs were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression ofNOX2 andNOX3 mRNAs were significantly increased in the gastric cancer compared to non-cancerous tissues and specimens of chronic gastritis. There was no significant difference inNOX2 mRNA expression between tumor-matched normal mucosa and tissue of chronic gastritis, and the expression ofNOX3 mRNA was also very low.ConclusionNADPH oxidase ofNOX2 andNOX3 may play an important role in the process of the occurrence and development of gastric cancer.

NADPH oxidase；NOX2；NOX3；gastric cancer；chronic gastritis

國家自然科學基金(No.81370487)

2015-01-11

河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽471003

李宏謙(1982-)，男，河南清豐人，碩士研究生在讀，從事消化系統疾病的臨床檢驗和診斷學研究。

高強，男，博士，主任醫師，碩士生導師，E-mail：gaoq37@yeah.net

R573.9

A

1672-688X(2015)01-0001-03