填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶催化合成雙果糖酐Ⅲ的研究

杭 華,鮑士寶,王 波,周守標,江 波

(1.安徽師范大學環境科學與工程學院,安徽蕪湖 241003;2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶催化合成雙果糖酐Ⅲ的研究

杭 華1,鮑士寶1,王 波1,周守標1,江 波2

(1.安徽師范大學環境科學與工程學院,安徽蕪湖 241003;2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

本文建立了填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶水解菊糖的工藝。以菊糖為底物,探究該工藝水解菊糖的條件,以單因素實驗為基礎,依據正交實驗優化,考察菊糖濃度、反應時間、反應溫度及底物流速等因素對雙果糖酐Ⅲ含量的影響,獲得最佳的工藝條件。該工藝采用填充床反應器的容積為20mL,固定化酶的裝載量為15mL。結果表明:菊糖濃度為100g/L,反應時間為1h,溫度為60℃,底物流速為20mL/h,在該工藝條件下制取雙果糖酐Ⅲ的濃度為67.38g/L。該工藝能持續操作48d以上,半衰期為48d,為該工藝大規模生產提供理論與操作的基礎。

雙果糖酐Ⅲ,固定化菊糖果糖轉移酶,正交實驗,穩定性

菊糖果糖轉移酶(EC4.2.2.18,Inulin fructotransferase,縮寫為IFTase)能水解菊糖生成雙果糖酐Ⅲ(即DFA Ⅲ)。DFA Ⅲ是低甜度與低熱量的新型甜味劑,其生理功能具有增進骨骼的鈣吸收、利于排尿、提高礦物質和黃酮類化合物的吸收、預防結腸癌及抑制蛀牙等,因而其能廣泛地應用于食品和醫藥領域[1]。DFA Ⅲ利用微生物產菊糖果糖轉移酶催化水解菊糖來制備,已發現10余種微生物(主要為節桿菌屬)可以產生此酶[2]。DFA Ⅲ主要是采用IFTase酶直接水解菊糖進行制備,利用微生物產IFTase酶水解菊糖。IFTase游離酶水解制取DFA Ⅲ的問題是耗時且勞動強度大,參與反應的催化劑酶無法重復利用而造成浪費,產物的產率低,反應結束后需要高溫或調pH來使酶失活,能量消耗大等不利方面。固定化酶具有重復利用、易回收及生產成本低等優點,應用較為廣泛。目前,采用固定化酶的方法制備雙果糖酐Ⅲ的報道較少,Kazutomo Haraguchi[3]等報道Chitopearl BCW3510結合戊二醛固定化IFTase酶,重復利用8次酶活力損失少;Ulrich Jahnz[4]等報道利用海藻酸鹽結合殼聚糖與戊二醛包埋IFTase表達酶具有較好的耐熱性,其適合于重復利用。海藻酸鹽包埋固定化酶已經應用于塔格糖制備[5]、氯仿降解[6]、低聚果糖的工業化制取[7]等。采用填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶催化制取DFA Ⅲ,其反應條件溫和、固定化酶反復利用及利于產物制備。本研究以菊糖為底物,進行單因素實驗;在此基礎上,采用正交實驗優化對填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶催化水解菊糖的因素進行探究,獲得最佳的操作工藝

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃節桿菌 江南大學國家重點實驗室;菊糖 上海譜振生物科技有限公司;雙果糖酐Ⅲ 日本大阪光純化學工業公司;海藻酸鈉、明膠及其他試劑 均為分析純,中國國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;冷凍離心機、電子天平 上海精密儀器有限公司;高效液相色譜 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊糖果糖轉移酶 菊糖果糖轉移酶來源于金黃節桿菌,將金黃節桿菌的發酵液離心,除去菌體,保留上清液即為粗酶液。采用超濾方法除去上清液中的小分子雜質,濃縮液即為簡易純化酶,低溫保藏用于固定化酶。

1.2.2 酶的固定化 將海藻酸鈉和明膠分別在60℃預先保溫溶解,3mL IFTase酶液(酶活約為300U/mL)與6mL海藻酸鈉溶液充分混合攪拌,再加入3mL明膠溶液,混合乳化30～40min(50℃)。用注射器混合液滴入氯化鈣液中,形成均一光滑的顆粒,0～4℃條件下靜置硬化4～6h。將獲得顆粒用生理鹽水和去離子水洗滌,抽濾干燥即得固定化酶,顆粒狀固定化酶的直徑約5mm,機械強度較好,酶的比活力為68.4U/g(酶活/固定化酶濕重),保存于0～4℃條件下待用。

1.2.3 固定化酶反應器水解菊糖的持續操作 持續的固定化酶填充床反應器包括:雙層玻璃柱和固定化菊糖果糖轉移酶。持續反應器系統的示意圖,見圖1。通過循環水浴加熱,填充床反應器維持適宜的反應溫度。從反應器底部通入一定流速的底物,便于反應器操作,盡可能減少固定化酶自身擠壓而導致堵塞問題。

圖1 填充床反應器固定化酶持續水解菊糖的示意圖Fig.1 The diagram of bed reactor with immobilized enzyme for continuous inulin hydrolysis

1.2.3.1 單因素實驗 按照1.2.2酶的固定化方法,制取固定化菊糖果糖轉移酶,將其裝入流化床反應器。探究影響固定化酶填充床反應器催化水解菊糖的因素:菊糖濃度(m/V)為20～120g/L,流速為5～30mL/h,溫度為30～90℃,反應時間為0～1.5h。反應產物主要有DFA Ⅲ與較少量低聚果糖等。樣品收集分析之前,依據每個流速達到穩定態的保留時間,反應器平衡2～10h。采用HPLC檢測,研究酶催化水解菊糖生成DFA Ⅲ含量。

1.2.3.2 正交實驗 在上述反應因素的實驗基礎上,選擇菊糖濃度(A)、反應時間(B)、反應溫度(C)與底物流速(D)4個因素為自變量,設計了一個4因素3個水平的正交實驗,各因素依據表1,設定主要考察指標為DFA Ⅲ含量(Y),分析研究影響填充床固定化菊糖果糖轉移酶催化制備DFA Ⅲ含量的主要因素。

表1 正交實驗分析因素與水平

1.2.4 高效液相色譜分析方法 樣品采集:依據1.2.3收集到樣品,20g/L菊糖濃度的產物不需要稀釋,其他濃度菊糖產物按照菊糖濃度與20g/L菊糖濃度的比例進行稀釋。采集的樣品過0.22μm纖維素膜后取10μL進HPLC(高效液相色譜)分析。

1.2.5 高效液相色譜分析條件 HPLC檢測條件:糖柱(Waters Sugur-PakTM1,6.5×300mm);流動相,超純水;示差折光檢測器(Shodex RI101);柱溫,80℃;流速,0.4mL/min;進樣量,10μL。

1.2.6 實驗數據處理 本文中,實驗均進行三次操作,統計數值并計算平均值,平均值表示實驗數值,誤差棒表示實驗重復數值的誤差。應用Origin 7.5軟件(美國OriginLab 中國分公司,中國廣州)來統計分析。

2 結果與討論

2.1 菊糖水解產物的HPLC圖譜

依據1.2.4的HPLC分析方法,IFTase催化水解菊糖的產物為DFA Ⅲ以及少量的低聚果糖,見圖2。由圖可以看出,未反應菊糖出峰時間為6.394min,低聚果糖(蔗果四糖、蔗果三糖、蔗果二塘)的出峰時間分別為7.197、7.643及8.372min,DFA Ⅲ出峰時間為9.748min。菊糖轉化率(生成DFA Ⅲ)能達到80%。

圖2 菊糖水解產物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC scheme of inulin hydrolysis products

2.2 反應因素的確定

2.2.1 菊糖濃度的影響 依據1.2.3.1方法,在反應溫度為60℃、反應時間為1h與底物流速為20mL/h的條件下,研究DFA Ⅲ得率與菊糖濃度的關系,見圖3。由圖3可知,底物菊糖濃度由20～80g/L,DFA Ⅲ含量變化不大;當菊糖濃度大于80g/L時,DFA Ⅲ含量降低較為顯著。菊糖濃度為20、40、60、80、100、120g/L時,DFA Ⅲ含量分別為16.7、32.8、48.9、64.6、78.4、90.2g/L。隨著菊糖濃度的升高,DFA Ⅲ含量也逐漸提高,反應進程符合酶反應方程動力學,底物濃度的增加會促使反應向產物濃度增加的方向進行。然而,隨著底物濃度的持續升高,因高濃度底物對酶具有競爭性抑制作用,菊糖轉化效率(即酶的催化效率)降低。綜合考慮上述影響因素,選擇菊糖的濃度為80g/L。

圖3 菊糖濃度與DFA Ⅲ得率的關系Fig.3 Relations of inulin concentration and DFA Ⅲ yield

2.2.2 反應時間的影響 依據1.2.3.1方法,在反應溫度為60℃、底物濃度為80g/L與底物流速為20mL/h的條件下,研究反應時間對酶催化水解反應的影響,結果見圖4。從圖4可以看出,隨著反應時間的增加,DFA Ⅲ濃度也逐步提高;反應時間為60min(即1h)時,DFA Ⅲ含量基本保持不變,反應達到平衡。隨著反應時間的延長,DFA Ⅲ濃度增加趨于平衡,考慮到反應成本、時間及DFA Ⅲ含量等因素,選擇反應時間為1h。

圖4 反應時間與DFA Ⅲ含量的關系Fig.4 Relations of reaction time and DFA Ⅲ content

2.2.3 溫度的影響 依據1.2.3.1方法,在反應時間為1h、底物濃度為80g/L與底物流速為20mL/h的條件下,研究反應溫度對酶催化水解反應的影響,結果見圖5。從圖5可以看出,隨著反應溫度的升高,DFA Ⅲ含量也逐步提高;當溫度為60℃時,DFA Ⅲ含量達到平衡;溫度繼續升高,DFA Ⅲ含量增加緩慢;溫度過高,DFA Ⅲ含量出現下降趨勢,表明溫度是影響酶催化水解的主要因素之一?？紤]持續實驗中酶活力下降及溫度等的影響,依據酶的耐受溫度范圍及升高溫度增加酶催化水解效率,選擇反應溫度為60℃。

圖5 反應溫度與DFA Ⅲ含量的關系Fig.5 Relations of reaction temperature and DFA Ⅲ content

2.2.4 底物流速的影響 依據1.2.3.1方法,在反應時間為1h、反應溫度為60℃與底物濃度為80g/L的條件下,研究底物流速對酶催化水解反應的影響,結果見圖6。從圖6可以看出,當底物流速為5～20mL/h時,隨著底物流速的增加,DFA Ⅲ含量呈現緩慢下降的趨勢;當流速大于20mL/h時,DFA Ⅲ含量下降加快,說明流速過快,底物與酶反應不完全,酶的催化水解效率降低。底物流速適當地增加,能提高單位時間內產物的含量;因此,選擇底物流速為20mL/h。

圖6 底物流速與DFA Ⅲ含量的關系Fig.6 Relations of substrate velocity and DFA Ⅲ content

2.3 DFA Ⅲ制備條件的正交優化

2.3.1 正交實驗 正交實驗結果見表2所示,影響酶活的因素依次為B>D>A>C;獲取DFA Ⅲ含量最高的組合為A3B2C2D1,通過優化結果進行實驗,獲得DFA Ⅲ含量為68.62g/L。根據單因素實驗的結果,底物流速的提高可以增加單位時間內產物量,這對于實際應用具有重要意義,采用A3B2C2D2進行實驗,獲得DFA Ⅲ含量為67.38g/L。因此,確定流化床反應器固定化酶水解菊糖的操作條件為:菊糖濃度為100g/L,反應時間為1h,反應溫度為60℃及底物流速為20mL/h。

表2 流化床反應器固定化酶操作條件的正交實驗

2.3.2 填充床反應器的操作穩定性 在上述研究的基礎上,探究填充床反應器的操作穩定性。操作的優化條件:菊糖濃度為100g/L,反應溫度為60℃,底物流速為20mL/h。利用HPLC檢測并計算菊糖水解液中DFA Ⅲ的含量與相對酶活的變化。由圖7可知,持續操作3d,獲得DFA Ⅲ的含量為67.38g/L且幾乎維持不變;持續操作8d,獲得DFA Ⅲ的含量為62.57g/L;持續操作40d,獲得DFA Ⅲ的含量為41.32g/L,反應器持續操作48d后,獲得獲得DFA Ⅲ的含量為34.21g/L。由圖8可以看出,首次用于催化水解菊糖的固定化酶相對酶活為100%,隨著操作時間的增加,相對酶活逐漸降低;反應器持續操作48d,相對酶活降低至50%。綜上所述,填充床反應器持續操作的半衰期為48d。

圖7 操作時間與DFA Ⅲ含量的關系Fig.7 Relations of operation time and DFA Ⅲ content

圖8 相對酶活與操作時間的關系Fig.8 Relations of operational time and relative enzyme activity

3 結論

本文建立了填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶持續水解菊糖制取DFA Ⅲ的操作系統,該系統的容積為20mL,固定化酶的裝載量為15mL。探討了該系統進行菊糖濃度、反應時間、反應溫度、底物流速等單因素實驗;在此基礎上,應用正交實驗軟件分析菊糖濃度、反應時間、反應溫度、底物流速等因素對制取DFA Ⅲ的影響,優化確定填充床反應器固定化菊糖果糖轉移酶催化水解菊糖的最適工藝條件:菊糖濃度為100g/L,反應時間為1h,反應溫度為60℃,底物流速為20mL/h。該操作系統的持續進行48d,DFA Ⅲ的含量由62.57g/L減少至34.21g/L,相對酶活降低至初始固定化相對酶活的一半,該操作系統的半衰期為48d。

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Study on the process of bed reactor with immobilized inulin fructotransferase for catalytic synthesis of DFA Ⅲ

HANG Hua1,BAO Shi-bao1,WANG Bo1,ZHOU Shou-biao1,JIANG Bo2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Anhui Normal University,Wuhu 241003,China;2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The process of bed reactor with immobilized inulin fructotransferase for inulin hydrolysis was founded. The conditions of inulin hydrolysis were explored. Based on single factors experiments,orthogonal experiment was adopted to investigate the influences of inulin concentration,reaction time,reaction temperature and substrate velocity on DFA Ⅲ contents. The optimal conditions were obtained. This process was adopted with the volume of packed bed reactor for 20mL and loading amount of immobilized enzyme for 15mL. The best results were attained with inulin concentration 100g/L,reaction time 1h,reaction temperature 60℃ and substrate velocity 20mL/h. DFA Ⅲ concentration was 67.38g/L at the conditions of this process. The process could continue to operate over 48 days. The half-life of operation was 48 days. The foundation was provided for the theory and operation of mass production.

difructose anhydride Ⅲ;immobilized inulin fructotransferase;orthogonal experiment;stability

2014-06-25

杭華(1977-),男,博士,講師,研究方向:食品生物新技術。

2013年校項目培育基金項目(160-71361);安徽師范大學12博士科研啟動項目(161-070110)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)07-0192-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.032