桂芍知母湯對類風濕關節炎模型鼠滑膜組織血管內皮生長因子的影響

孫 乾，王金春，孫 鋒

桂芍知母湯對類風濕關節炎模型鼠滑膜組織血管內皮生長因子的影響

孫 乾，王金春，孫 鋒

目的 觀察桂芍知母湯對膠原誘導類風濕關節炎(CIA)模型鼠血管內皮生長因子(VEGF)的影響，探討其作用靶點。方法 將40只健康雌性大鼠隨機分為正常組、模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組，除正常組之外,其余各組使用Ⅱ型膠原誘導大鼠造成CIA模型。桂芍知母湯組、來氟米特組，造模后開始給藥,共計30 d。按評分法評價關節炎指數,ELISA法檢測VEGF表達。結果 給藥組較模型組關節發病數目減少，關節腫脹程度減輕，皮膚紅腫不明顯，關節變形程度減輕。給藥組與模型組在關節炎指數方面比較有明顯差異(P<0.05)。給藥組CIA大鼠踝關節滑膜組織升高的VEGF水平顯著降低(P<0.01)。結論 桂芍知母湯組與模型組比較,關節炎指數明顯降低,大鼠踝關節滑膜組織VEGF水平明顯下降。

桂芍知母湯；類風濕關節炎；血管內皮生長因子

0 引言

類風濕關節炎(RA)可導致滑膜和關節軟骨損傷,進而出現骨破壞,使患者關節畸形、功能障礙。治療的關鍵在于阻止骨破壞及改善局部癥狀。西藥在治療本病時，明確提出控制病情及改善癥狀。中藥在治療RA 時，是否有類激素樣作用，或者通過阻止骨破壞起到控制病情的作用目前尚無系統研究。本研究從一般形態學、分子生物學方面觀察了經方桂芍知母湯抑制類風濕關節炎骨破壞的生物學效應，為臨床治療此病正確選擇用藥提供充分的證據，為中醫經方的科學應用提供有力的支撐。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 普通級健康雌性大鼠40只，體重(146±20)g，由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗藥品及制備 方用桂芍知母湯[1]：桂枝12 g、白芍藥9 g、甘草6 g、麻黃6 g、生姜15 g、白術15 g、知母12 g、防風12 g、炮附子9 g購自遼寧中醫藥大學附屬醫院，在遼寧中醫藥大學實驗室煎煮。對照組用藥：來氟米特片[2](蘇州長征欣凱制藥有限公司，批號：110221)。

1.1.3 主要試劑 弗氏完全佐劑：購自北京欣惠澤奧科技有限公司，批號：049k8700。血管內皮生長因子試劑盒：美國Initorgenv公司。

1.1.4 主要儀器及設備 電子天平：瑞士precisa，型號：xs-225A；低速臺式離心機：北京醫用離心機廠，型號：LD4-ZA；熒光顯微鏡：日本奧林巴斯，型號：BX51TRF；全自動酶標儀：奧地利Anthosl，型號：17550；以上均由遼寧中醫藥大學分子生物學實驗室提供。

1.1.5 實驗室 整個實驗均安排在遼寧中醫藥大學清潔級實驗室中實施。本課題涉及實驗室-分子生物學實驗室系國家中醫藥管理局局級科研三級實驗室(2002年批準)。

1.2 實驗方法與結果

1.2.1 實驗動物分組 選擇雌性健康大鼠40只，體重(146±20)g，鼠齡4～5周。隨機選10只為正常鼠，另外30只建立Ⅱ型膠原蛋白誘導的RA大鼠模型[3]。后者隨機分成：模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組，10只為一組。正常組大鼠每只左后足跖皮內注射生理鹽水100 μL。

1.2.2 模型制備 隨機取10只為正常組，另外30只建立Ⅱ型膠原蛋白誘導的大鼠RA模型,將酸溶性膠原蛋白[collagen(Ⅱ)]用弗氏完全佐劑配成CⅡ濃度為2.5 mg/mL的乳劑,在每只大鼠左后足跖皮內注射100 μL乳劑(含CⅡ250 μg)。

1.2.3 處理因素 ①模型組：造模后10 d開始給予生理鹽水2 mL/(只·d)灌胃。②其他組:造模后10 d,按照鼠-人的折算劑量分別以不同藥物灌胃,1次/d。③正常組:不做任何處理。

1.2.4 取材 以上各組大鼠治療30 d后，先做一般形態學觀察，取雙側踝關節,放置在含多聚甲醛和焦碳酸二乙酯(DEPC)的固定液中固定備用。

1.2.5 指標檢測 大鼠足跖的外觀：觀測其腫脹程度，計算出關節炎指數。關節炎指數計算：觀察并記錄全身關節病變程度，關節病變按4級評分法評價，根據四肢各肢體的病變程度累計積分，計算出關節炎指數。0分：無紅腫;1分：1個趾關節紅腫；2分：2個趾關節紅腫；3分：3個及以上趾關節和跖足腫脹。各個關節的積分累計，即為每只小鼠的關節炎指數，最大值為12。治療前，模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組關節炎指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。大鼠踝關節滑膜組織血管內皮生長因子[4]檢測：ELISA法檢測滑膜VEGF的水平,嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 數據統計 所有實驗數據應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般形態學考察 桂芍知母湯組及來氟米特組較模型組關節發病關節腫脹及關節變形程度明顯減輕，關節變形數目明顯減少,桂芍知母湯組及來氟米特組與模型組關節炎指數均大幅度下降。見表1。

表1 各組模型大鼠關節炎指數比較

注：與模型組比較,*P<0.05

2.2 ELISA法檢測結果 CIA造模后治療30 d，經ELISA法檢測：模型組大鼠踝關節腫脹明顯，大鼠滑膜組織VEGF水平明顯升高，桂芍知母湯及來氟米特組與模型組比較關節腫脹明顯減輕，大鼠滑膜組織VEGF水平明顯下降。與正常組比較,模型組大鼠滑膜組織VEGF水平明顯升高(P<0.01),桂芍知母湯組及來氟米特組均能明顯降低大鼠滑膜組織升高的VEGF水平(P<0.01),桂芍知母湯組與來氟米特組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組模型大鼠滑膜組織VEGF水平的比較

注：與模型組比較,*P<0.01

3 討論

RA是一種慢性侵襲性關節炎性疾病，若得不到有效治療，會導致患者的關節功能喪失，進而造成患者生活自理能力及勞動能力的喪失，給社會及家庭造成嚴重的心理及經濟負擔，是我國人群喪失勞動力和致殘的主要疾病之一。因此，延緩甚至阻斷骨質破壞成為RA治療的重要目標之一?；ぱ资且疖浌瞧茐腫5]和骨侵蝕[6]繼而引起關節強直、畸形、功能喪失的重要標志。

RA的滑膜病變表現為滑膜組織的異常增生,血管翳形成,甚至嚴重影響關節周圍組織,具有類腫瘤樣生長的特點。上述特點與本實驗模型組大鼠踝關節病理變化相符合。許多生長因子和大量炎性因子參與此病理過程,VEGF是滑膜炎癥發展及滑膜血管翳形成的十分重要的炎性因子之一。VEGF的分子量約為46 kD，其性質是高度糖基化的堿性蛋白,同時也是內皮細胞的特異性有絲分裂原。VEGF直接通過滑膜細胞、血管內皮細胞及浸潤的單核巨噬細胞等起作用,是一種強有力的促血管生成因子，其主要靶細胞是血管內皮細胞,通過增加血管內皮細胞的有絲分裂,促進新生血管形成,VEGF廣泛存在于RA的滑膜和滑膜液中。有實驗證明，血管平滑肌細胞、梭樣襯里內層細胞、巨噬樣滑膜襯里細胞均有VEGF表達。近年來的研究又發現，RA的關節軟骨細胞、肥大細胞、淋巴細胞均有豐富的VEGF表達，滑膜液的成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞可以分泌VEGF。Dufe等[7]發現，VEGF在滑膜和滑膜表面表達顯著。在鄰近區發現121酪氨酸激酶1表達VEGF，可以解釋fms酪氨酸激酶Ⅰ在滑膜表面附近的血管上出現；DeBandt等[8]研究發現，接近人類關節炎造模鼠關節滑膜細胞能夠表達VEGF、含激酶插入功能區受體、121樣酪氨酸激酶1胎肝激酶1。RA的病理性新生血管形成過程中有多種血管新生相關因子參與。有研究表明，VEGF與內皮抑制素失衡是RA血管新生的罪魁禍首[9]。其作用機制為：VEGF等促血管生成因子與內皮抑制素[10]等抑制血管生成因子之間失衡,導致細胞凋亡抵抗性升高，從而使多種調節因子誘導VEGF持續高水平表達，VEGF與其受體結合，啟動信號轉導通路，導致血管周圍細胞外基質的異常降解、內皮細胞的遷移和異常增殖、毛細血管的分化和吻合，進一步形成新生血管。VEGF在RA整個病理性新生血管形成過程中起著不可或缺的作用。

長期以來，中藥對RA的治療優勢已被業內人士所公認，但缺乏中藥對RA的作用靶點及作用機制系統深入的研究。本實驗觀察了桂芍知母湯對RA大鼠關節炎發展的影響,實驗結果顯示，經桂芍知母湯治療后,CIA大鼠關節炎指數明顯降低，損傷程度明顯減輕,表明桂芍知母湯具有良好的抗炎、抑制骨破壞的作用。同時實驗進一步觀察了桂芍知母湯治療RA大鼠的作用機制,結果發現,經桂芍知母湯治療后,RA大鼠滑膜組織VEGF水平明顯下降，表明桂芍知母湯是通過抑制VEGF的生成而起到對CIA大鼠抗炎、抑制骨破壞的作用。

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[4] 嚴瀚,劉恩志,周漢城,等.類風濕關節炎中巨噬細胞移動抑制因子對內皮細胞功能及血管內皮生長因子的影響[J].中華關節外科雜志(電子版),2013,7(3):373-377.

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[10]嚴瀚,劉恩志,周漢城,等.類風濕關節炎中巨噬細胞移動抑制因子對內皮細胞功能及血管內皮生長因子的影響[J].中華關節外科雜志(電子版),2013,7(3):373-377.

Influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor in sliding membrane tissue of rheumatoid arthritis model rats

SUN Qian,WANG Jin-chun,SUN Feng

(Department of Rheumatology and Immunology,Shenyang Fifth People Hospital,Shenyang 110023,China)

Objective To observe the influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor(VEGF) in rheumatoid arthritis(CIA) model of mice induced by collagen,and discuss the acting targets.Methods 40 healthy female rats were randomly divided into normal group,model group,fluorine mitt group and Guishao Zhimu decoction group.All groups were induced by using Ⅱ type collagen to form the CIA model in rats except the normal group.The arthritis index was evaluated by using score method,vascular endothelial growth factor (VEGF)expression was evaluated by using ELISA method in Guishao Zhimu decoction group and fluorine mitt group after 30 d of treatment.Results Compared with model group,the numbers of joint disease reduced,the degree of joint swelling relieved,skin irritation disappeared,the degree of joint deformation alleviated in the medication group.There was significant difference in arthritis index between the medication groups and model group(P<0.05).The increased levels of VEGF in ankle synovial tissue of rheumatoid arthritis significantly reduced in medication group(P<0.01).Conclusion Compared with model group,the arthritis index and ankle synovial tissue VEGF levels of rats in Guishao Zhimu decoction group significantly decreased.

Guishao Zhimu decoction;Rheumatoid arthritis;Vascular endothelial growth factor

2014-06-28

沈陽市第五人民醫院風濕免疫科，沈陽 110023

10.14053/j.cnki.ppcr.201503002