響應面Box—Behnken設計優化超聲提取桑椹多酚條件

韋麗文 陳振建

【摘要】 目的：利用響應面Box-Behnken設計優化超聲提取桑椹多酚工藝條件。方法：選擇乙醇濃度、桑椹粉碎度、料液比、提取時間4個因素進行單因素考察，在此基礎上，用響應面Box-Behnken設計對影響較大的單因素進行3因素3水平響應面分析，以確定最佳提取條件。結果：桑椹多酚類化合物的最佳提取工藝為乙醇濃度為44.6%、桑椹粉碎度為120目、料液比為1∶34（g/ml）。結論：響應面Box-Behnken設計能優化超聲提取桑椹多酚提取條件，提高桑椹多酚提取得率。

【關鍵詞】 響應面法；Box-Behnken設計；超聲提??；桑椹多酚

【中圖分類號】R284.2【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）10-0025-03

Optimization of the parameters on extraction of Polyphenol from Mori Fructus with ultrasonic wave technology by Box-Behnken design-response surface method

WEI Liwen1CHEN Zhenjian2

1.Guangxi university of Chinese medicine，Guangxi Nanning 530001；2. The pepole′s hospital of Guangxi Lingshan county，Guangxi Lingshan 535400

Abstract：Objective To optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus by the response surface method. Method Base on ethanol concentration， comminution degree， the liquid-solid ratio， ultrasonic time of single factor experiment， the BoxBehnken design for 3 star factor 3 level response surface methodology was applied， to ascertain the best extraction condition. Results The ethanol concentration of 44.6%， comminution degree of 120 section and liquid-solid ratio of 34.1∶1 were selected as the optimum conditions. Conclusion Box-Behnken design of response surface methodology was applied to optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus

Keywords：the response surface method；Box-Behnken；ultrasonic extraction； polyphenol of Mori Fructus

桑椹Mori Fructus為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的果實，為藥食兩用之佳品，具有滋陰補血、生津潤燥的功效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、心悸失眠、須發早白、津傷口渴、內熱消渴、腸燥便秘[1]?！侗静菥V目》記載“椹有烏、白二種”?！端臅r月令》云“四月宜飲桑椹酒，能理百種風熱?！薄侗静菪戮帯酚性啤八脑虏缮ｉ刀?，飯鍋蒸熟曬干即可為末”。多酚廣泛存在于植物體中，也是桑椹中的主要成分，其主要包括黃酮類、棓酸類及黃烷醇類等，具有抗氧化、抗菌、防癌抗癌等作用[2-4]。超聲廣泛用于有效成分提取，其可加速成分進入溶劑，保持被浸提的生物活性物質在短時間內保持不變，極大提高提取效率[5]。Box-Behnken設計是用來評價因素指標和因素間非線性關系的一種試驗設計方法，具有試驗次數相對較少，評價準確的優點，廣泛用于中藥有效成分的提取條件優化。本文在單因素實驗的基礎上，運用響應面Box-Behnken設計優化超聲提取桑椹多酚條件，為今后桑椹多酚資源更好地利用墊定了基礎。

1儀器與材料

1.1儀器粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；島津UV-1800紫外分光光度計；Elmasonic P300H超聲清洗器；梅特勒-托利多電子分析天平。

1.2試劑與材料桑椹采于廣西蠶業推廣總站，經廣西蠶業技術推廣總站朱方容研究院鑒定為?？浦参飶V東桑Morus atropurpurea Roxb.的果穗。沒食子酸（天津市光復精細化工研究所）、乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）、Na2CO3（天津博迪化工股份有限公司）、福林酚試劑（上海荔達生物科技有限公司）均為分析純。

2方法

2.1桑椹藥材處理將采回的桑椹用沸水蒸1min后置于鼓風干燥箱，55℃烘干，打粉，過篩。

2.2桑椹多酚測定方法桑椹多酚測定方法參照李巨秀[6]多酚測定方法，在此基礎上稍作改進。

2.2.1沒食子酸標準溶液配制取沒食子酸標準品適量，精密稱定為0.0020g，用純水溶解并定溶于100ml容量瓶，得質量分數為20mg/L的對照品標準液。

2.2.2最佳測定波長的確定用移液槍吸取1.0ml的沒食子酸標準溶液和桑椹多酚提取液分別置于10ml的容量瓶中，分別加入1mol/l 福林酚試劑1ml，混勻，加入2ml質量濃度為0.15g/ml Na2CO3溶液，充分混勻后定容，室溫避光放置80min后進行紫外全波長（200～800）光譜掃描，并設試劑空白對照，最終確定760nm為最大吸收波長。

2.2.3沒食子酸標準曲線繪制準確吸取沒食子酸標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml于10ml容量瓶中，分別加入1mol/l 福林酚試劑1ml，混勻，再加入0.15g/ml Na2CO3溶液2ml，充分混勻后定容，配成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L沒食子酸樣品溶液，室溫避光放置80min。以不加標準液的溶液為空白對照，在760nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪制標準曲線為A=0.0953X+0.0675（r=0.9989），表明在2～12mg/L范圍內線性關系較好。

2.3超聲提取單因素實驗選取乙醇溶度、桑椹粉碎度、料液比、超聲時間4個因素作單因素實驗，進行超聲提取后取1ml粗提液用2.2下方法測其吸光度，帶入回歸方程中計算多酚濃度（mg/l），從而得到多酚提取質量。

2.4Box-Behnken響應面設計在單因素實驗的基礎上選取對桑椹多酚提取率影響較大的乙醇濃度（%）、桑椹粉碎度（目）、料液比（g/ml）三個因素三水平為自變量進行Box-Behnken實驗設計。多酚提取質量（mg）為因變量，選取的三因素分別編碼為乙醇濃度A、粉碎度B、料液比C，三水平分別用-1、0、1表示，編碼因素及水平見表1。

表1Box-Behnken設計因素水平表

編碼因素

水平

-101

A乙醇濃度/ %405060

B粉碎度/目80100120

C料液比1∶20 1∶301∶40

3結果與分析

3.1單因素實驗

3.1.1乙醇濃度對多酚提取質量的影響稱取桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，分別加入濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液10ml，超聲提取30min，提取溫度60℃，4000r離心，取上清液，測多酚含量。結果桑椹多酚提取質量隨著乙醇濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為40%時多酚提取質量達到最高，因此最佳的乙醇濃度為40%，如圖1所示。但考慮到有機溶劑對多酚提取能起到氫鍵斷裂作用（有機溶劑所占比例最佳為50%～70%）[7]。因此選取40%、50%、60%，三水平再做響應面分析。

3.1.2粉碎度對多酚提取質量的影響分別稱取過3號50目、4號65目、5號80目、6號100目、7號120目篩的桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，加入50%乙醇10ml，超聲提取30min，提取溫度60℃度，4000r離心，取上清液，測定多酚含量，結果桑椹多酚的提取質量隨著桑椹粉碎度的增加而增加，在粉碎達到120目時，多酚提取質量達到最大，因此最佳粉碎度為120目，如圖2所示。

3.1.3料液比對多酚提取質量的影響稱取過120目篩的桑椹粉末0.5g于50ml具塞三角瓶中，以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分別加入50%乙醇5、10、15、20、25ml，超聲提取30min，提取溫度60℃，4000r離心，取上清液，測多酚含量，結果桑椹多酚提取質量隨著料液比的增大而增大，當料液比為1∶40時，多酚提取質量達到最大，因此最佳料液比為1∶40，如圖3所示。

3.1.4超聲提取時間對多酚提取質量的影響稱取過120目篩的桑椹粉末0.25g，共6份于50ml具塞三角瓶中，各加入50%乙醇15ml，分別提取10、20、30、40、50、60、70min，提取溫度60℃，4000r離心，去上清液，測多酚含量。結果多酚提取質量與提取時間無明顯線性關系，提取時間為20min時，提取多酚質量最多，與30、50min提取時間相當，如圖4所示。

根據單因素實驗結果，可確定桑椹多酚提取的最佳單因素條件為：乙濃度40%，桑椹粉碎度為120目，料液比1∶40，超聲時間20min。

3.2響應面試驗與分析響應面分析方案與結果見表2.

3.2.1多元二次回歸模型的建立利用Design-Expert8.5.0 軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，獲得超聲提取桑椹多酚質量（Y）對乙醇濃度（A）、桑椹粉碎度（B）、料液比（C）的二次多項回歸模型方程為：Y=14.07-0.63A+1.67B+0.49C-0.77AB-1.29A2-0.59C2。

式中Y為多酚提取質量（mg），A為乙醇濃度（%），B為粉碎度（目），C為料液比（g/ml）。AB為乙醇濃度和粉碎度的交互項，A2為乙醇濃度的二次項，C2為料液比的二次項。

表2Box-Behnken設計響應面分析結果

實驗號ABCY（mg）

1-1-1011.397

21-1010.885

3-11016.427

411012.825

5-10-111.535

610-111.715

7-10113.08

810111.963

90-1-111.668

1001-114.448

110-1112.33

1201115.9

1300014.337

1400013.34

1500014.24

1600013.945

1700014.04

表3Box-Behnken設計回歸方程方差分析表

方差來源平方和自由度均方差F值P值顯著性

總模型38.5966.4323.9<0.0001**

A3.1913.1911.850.0063**

B22.18122.1882.41<0.0001**

C1.9111.917.090.0238*

AB2.3912.398.870.0138*

A27.0717.0726.280.0004**

C21.4811.485.480.0412*

殘差2.69100.27

失擬項2.0860.352.280.2227

純誤差0.6140.15

總變異41.2916

注：**P<0.01，*P<0.05。

利用Design-Expert8.0.61軟件的ANOVA分析響應面的回歸參數，回歸方程中各自變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值中，P ≤0.01的項，對Y影響極為顯著；P ≤0.05的項，對Y影響顯著；P>0.05的項，對Y影響不顯著，一般將該項剔除。模型項P ≤0.05說明Y與A、B、C回歸方程的關系是顯著的；P ≤0.01說明Y與A、B、C回歸方程的關系是極顯著的；P>0.05說明Y與A、B、C回方程的關系是不顯著的。失擬項的P>0.05，說明方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，方程表示Y與A、B、C的關系好。

由表3可以看出，該回歸方程模型的P<0.0001，說明該回歸方程具有極顯著性，試驗設計可靠；失擬項P=0.2227>0.05，說明回歸方程模型失擬不顯著；乙醇濃度（A）一次相及其二次項、粉碎度（B）一次相的P<0.01具有極顯著性。而料液比（C）一次相及其二次項，乙醇濃度和粉碎度的交互項的P<0.05，具有顯著性。從分析結果可知，對Y值的影響大小順序為：粉碎度（B）>乙醇濃度（A）>料液比（C）。

3.2.2效應面分析由3.2.1分析可知，只有AB交互項具有顯著性，通過Design-ExPert8.0.61軟件分析可以得出AB兩個因素交互影響超聲提取桑椹多酚的響應曲面和等高線圖，直觀的反映AB因素交互作用對響應值的影響，如圖2所示，B因素為粉碎度，隨著粉碎度的增加，響應面的平面最高，且達到最大值，而在A因素（乙醇濃度）的影響下，隨著乙醇濃度的增大，響應值先增大后減小，則當粉碎度取實驗最大值，乙醇濃度取實驗中間值時，響應值（桑椹多酚提取質量）最大，如圖5所示。

3.3驗證試驗以上述響應面優化條件，取乙醇濃度45%，桑椹粉碎度120目，料液比1∶34，進行超聲提取桑椹多酚，進行三組平行實驗，所得結果為桑椹多酚平均提取質量為16.18mg，與預測值16.43mg極為相近。

4結論

實驗研究超聲提取桑椹多酚的提取工藝條件，運用Design-Expert8.0.61軟件的Box-Behnken響應面設計優化提取條件，優化結果表明，乙醇濃度、粉碎度對桑椹多酚提取質量的影響有極顯著性，料液比對桑椹多酚提取質量的影響有顯著性。最優提取條件為乙醇濃度A為44.6%、粉碎度為120目、料液比為1∶34，多酚提取質量達到最大，其預測值為16.43mg。以響應面的優化條件進行超聲提取實驗，桑椹多酚提取質量為16.18mg，與預測最高值極為相近，說明該回歸方程模型有效，優化條件切實可行。響應面Box-Behnken設計可以用于有效成分的提取條件優化，通過回歸方程的建立，得出確切的優化值，并通過實驗的驗證，有效提高有效成分的提取率，為桑椹多酚資源的利用奠定了實驗基礎。

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（收稿日期：2015.04.03）