珠江流域野生黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco的Cyt b基因序列分析*

張鶴千，楊子拓，李桂峰，肖詩斌，孫際佳，楊慧榮，趙會宏，謝堂暉，韓興鵬，劉 麗

(1.華南農業大學動物科學學院，廣東廣州510642;2.中山大學生命科學大學院，廣東廣州510275;3.華南農業大學動物科學學院//廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東廣州510642)

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco在分類學上屬于硬骨魚綱、鲇形目Silurforwes、鲿科Siluridae、黃顙魚屬Pelteobagrus，俗名叫黃刺公、黃臘丁、黃刺骨等［1］。黃顙魚在靜水或緩流的淺灘生活，晝伏夜出，主食底棲脊椎動物，多為小魚、水生昆蟲等小型生物。黃顙魚是中國重要的小型經濟魚類，廣泛分布于長江、黃河、珠江、沅江及黑龍江等水域［2－3］。黃顙魚屬在我國主要有4種，分別為黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco、瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli、光澤黃顙魚Pelteobagrus nitidus、岔尾黃顙魚Pelteobagrus eupogon，其中黃顙魚是我國水產養殖品種中主要的增養殖對象，其次是瓦氏黃顙魚。珠江流域是由西江、北江、東江及珠江三角洲諸河等四個水系所組成的復合流域［4］。隨著經濟社會的發展，環境污染不斷地加劇，濫捕濫撈現象也日趨嚴重，致使野生黃顙魚的生活環境受到了嚴重破壞，野生種質資源數量呈現銳減趨勢。為了合理有效地保護野生黃顙魚群體以促進淡水漁業的長久發展，對珠江流域黃顙魚野生群體的種質資源進行研究已日顯重要。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)基因組內不同的區域進化速度存在差異，適合不同水平的進化研究［5］。近年來，隨著分子生物學技術向經典分類學領域的滲透以及魚類線粒體DNA研究技術的不斷發展成熟，使得mtDNA成為魚類學相關研究的理想的分子標記，并在魚類進化遺傳學、種群遺傳結構、分子生態學和保護生物學等方面的研究中取得了很多有意義的成果，解決了眾多疑難問題。細胞色素b(Cyt b)基因進化速度適中，適合于種間到種內水平上的系統發生研究，在魚類群體遺傳結構與系統發育關系中有著廣泛的應用［6］。目前，Cyt b基因是研究分子進化和系統發育最有用的基因之一，已廣泛應用于各種生物的系統發育研究中［7－9］，而且還被用于探討分歧時間較長的高級分類單元之間的系統發育關系［10］。

本文通過測定與分析珠江流域桂林江段、都勻江段、右江江段、左江江段、東江江段這5個江段的190尾野生黃顙魚個體的線粒體細胞色素b基因序列，探討珠江流域野生黃顙魚的種群遺傳多樣性和進化關系，在維護不同水系間遺傳多樣性和原有的生態平衡上具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗用魚 本實驗所用野生黃顙魚樣本于2012年6月至8月，采集于珠江流域各江段，分別為桂林江段 (GL)、都勻江段 (GZ)、右江江段(YJ)、左江江段 (ZJ)、東江江段 (DJ)，共計190尾，每個群體采集樣本數目見表1。野外現場取背部肌肉于無水乙醇中固定并帶回實驗室，超低溫保存。

1.1.2 主要儀器 PCR反應所用DNA擴增儀為南京貝登機電設備有限公司制造V123530型擴增儀，離心機為德國Eppendorf公司制造5810R型，凝膠成像系統為美國BIORAD公司制造的Bio-Rad Gel-Doc XR system PC型等。

表1 黃顙魚群體采樣信息Table 1 Pelteobagrus fulvidraco groups sampling information

1.2 試驗方法

黃顙魚的基因組DNA的抽提實驗采用天根生物海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANamp Marine Animals DNA Kit)，并根據本實驗室的實際情況對操作流程進行了部分更改。Cyt b基因擴增和測序的引物為通用引物序列［11］如下:

H15915:5'－CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC－3'，

L14724:5'－GACTTGAAAAACCACCGTTG－3'，引物由華大基因科技服務有限公司合成。

PCR反應總體積為50 μL體系，其中模板DNA2 μL，上游引物P1和下游引物P2(10 μmol/L)各 2 μL，2 ×PCR Reaction Mix25 μL，Taq DNA聚合酶 (2.5 U/μL)1 μL，無離子超純水為18 μL。擴增條件為:94℃預變性2 min后94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，共進行35個循環，最后72℃延伸7 min，16℃保存。擴增之后用w=1%的瓊脂糖凝膠電泳，BIORAD凝膠成像系統照膠并保存圖片。

1.3 測序與數據分析

PCR擴增產物直接送華大基因科技服務有限公司利用正反引物進行雙向測序獲得黃顙魚的Cyt b基因序列列，經過DNASTAR Inc軟件拼接后進行人工校對。用軟件Clustal-X對所獲得拼接序列進行對比分析［12］;用軟件DNASP5.0計算單倍型多樣性 (haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)和平均核苷酸差異數 (K±SD)3項群體遺傳多樣性指標，群體間的分化指數(F-statistics，Fst)以及群體遺傳變異的分子變異等級分析(analysis of molecular variance'AMOVA);通過公式Nm= ［(1－Fst)－1］/2計算得到群體間的基因流;MEGA5.0軟件統計DNA序列的剪輯組成、轉換、顛換和平均轉換率/顛換率、單突變位點、簡約信息位點、插入/缺失位點數;個體間、群體間和群體內的遺傳變異率由Kimura雙系數模型(Kimura2-parameter)計算所得;利用MEGA5.0軟件，最大似然法 (maximum-like-lihood，ML)構建聚類關系樹。

2 結果與分析

2.1 Cyt b基因序列特征

5個江段的野生黃顙魚mtDNA Cyt b的擴增產物利用Clustal-X 1.81和MEGA 5.0軟件進行人工比對序列，并對數據進行適當的剪切處理，確定黃顙魚Cyt b基因片段全長為1109 bp。由MEGA5.0軟件對1109 bp的序列進行分析可得，5個江段的190尾樣本基因片段中，T、C、A和G堿基平均含量分別為27.4%、31.0%、27.7%、13.8%，可見C堿基含量相對較高，G堿基含量相對較低，其中A+T的含量 (55.1%)顯著高于G+C含量(44.8%)，具體可見表2?？偣矙z測到43種單倍型，序列中東江 (DJ)、左江 (ZJ)和右江 (YJ)的樣品的變異位點數目均大于100個，分別為230(約占20.7%)、193(約占17.4%)、352(約占31.7%)個，都勻 (GZ)與桂林 (GL)江段的樣品的變異位點個數分別為8個和14個;5個江段的樣品檢測到的簡約信息位點分別是東江為192個、左江142個，右江307個，都勻4個，桂林5個 (表3)。經檢測群體內的轉換/顛換 (Ts/Tv)之比分別為:DJ為4.07，ZJ為3.91，YJ為2.44，GZ為8.25，GL為5.51。由轉換、顛換對遺傳距離圖 (圖1)可知:轉換和顛換數沒有達到平臺效應，即沒有達到飽和狀態，說明供統計分析的數據準確可靠。此外，都勻和桂林群體轉換位點均為1個，沒有顛換位點，轉換遠高于顛換，表明此片段沒有飽和，適合進行遺傳變異分析。

圖1 Cyt b基因轉換、顛換與遺傳距離之間關系的散點圖Fig.1 Transition and transversion substitutions vs.genetic distance of mitochondrial Cyt b gene

表2 黃顙魚線粒體Cyt b基因堿基組成Table 2 Base composition of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco %

表3 黃顙魚Cyt b基因序列保守位點、變異位點、簡約信息位點Table 3 The conserved sites、variable sites、parsimony-informative sites of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco 個

2.2 群體變異和遺傳結構

利用MEGA5.0軟件分析測序獲得的190尾樣品的mtDNA Cyt b基因序列，得到5個江段群體間的遺傳距離 (表4)。從種間遺傳距離來看，東江采樣的黃顙魚群體和右江采樣的黃顙魚群體的種群間的遺傳距離最遠為0.084，遺傳距離最近的為都勻和桂林群體 (0.001)。經比較分析，種群內部遺傳距離從大到小依次為:YJ(0.095)＞ZJ(0.068)＞DJ(0.053)＞GZ(0.001)=GL(0.001)。

從各個地理群體的核苷酸多樣性 (Pi)來看，核苷酸多樣性均在0.00072～0.08445之間，因此可以得出，黃顙魚各群體的線粒體Cyt b基因的核苷酸變異均處于較低水平，而從平均核苷酸差異數比較中，右江群體 (YJ)最高，其次依次為左江群體 (ZJ)、東江群體 (DJ)和桂林群體 (GL)，而都勻群體 (GZ)最低。

本實驗結果顯示，5個群體間的Fst及Nm值見表5，所示結果左江 (ZJ)與右江 (YJ)群體間的Fst值為0.02604，數值在0～0.05之間，表明2個黃顙魚群體間存在中等偏低的遺傳分化，不存在顯著的系統地理格局。本研究中群體間的遺傳分化系數在0.02604～0.41430之間，都勻 (GZ)跟廣西崇左 (ZJ)的遺傳分化程度最大，右江和左江的遺傳分化程度最小。在本實驗中，5個群體間的基因流系數Nm在范圍0.35342～9.35061之內，其中，GZ和ZJ的Nm值最小 (0.35342)，而ZJ和YJ的Nm值最大 (9.35061)。

分別將東江、桂林、都勻、左江和右江5個江段群體，左右江流域與東江流域二群體，左右江流域兩群體作為一個組，運用Arlequin軟件進行群體間的分子變異等級分析 (AMOVA)(表6)，結果表明:5個群體總的遺傳分化系數Fst=0.24774(P=0.00±0.000＊＊＜0.05)，差異極顯著。

表4 黃顙魚的Cyt b基因序列群體間遺傳距離Table 4 The interpopulation genetic distances of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco

表5 黃顙魚群體間的Fst(對角線下方)和Nm(對角線上方)Table 5 The interpopulation Fst(on triangle)and Nm(lower triangle)of Pelteobagrus fulvidraco

2.3 聚類分析

利用MEGA5.0軟件分析5個江段的黃顙魚個體的 mtDNA Cyt b基因序列，并用最大似然法(Maximum Likelihood)進行聚類分析，得到分子系統發生樹 (圖2)。圖中各枝上數字為1000次Bootstra P自展法檢驗統計分析后對該枝的支持率，數值越大，支持率越高，則表明該樹的可信度越高。一般認為，數值＞70%，即表明該枝的可靠性比較大。5個黃顙魚采樣江段中左江和右江群體先聚為一支，桂林和都勻聚為一支，采自于東江的3號個體單獨聚為一支。

表6 黃顙魚5個群體間遺傳變異的分子變異等級分析 (AMOVA)1)Table 6 Analysis of molecular variance(AMOVA)of five populations of Pelteobagrus fulvidraco

圖2 珠江水系野生黃顙魚Cyt b基因序列的ML分子系統樹Fig.2 The molecular phylogenetic tree of wild Pelteobagrus fulvidraco from the Pearl River by ML method based on Cyt b

2.4 中性檢測結果

通過應用DNASP5.0軟件分別對5個江段的野生黃顙魚Cyt b基因序列進行中性檢測，得到Fu's Fs值和Tajima's D值 (結果見表7)，從而揭示黃顙魚是否經歷過種群擴張。結果表明，桂林和都勻2個群體的 Fu's Fs值是小于0且 P值不顯著，Tajima's D檢驗D值小于0且P值不顯著，左江和右江群體Fu's Fs值是大于0且Tajima's D檢驗D值大于0，東江群體Fu's Fs值是大于0，Tajima's D檢驗D值小于0但P值不顯著。

表7 黃顙魚Cyt b基因Fu'S Fs和Tajima's D檢驗1)Table 7 The Test of Fu'S Fs and Tajima's D of mitochondrial Cyt b gene of Pelteobagrus fulvidraco

3 討論

遺傳多樣性 (Genetic diversity)是生物多樣性的核心，是生物種內和種間遺傳變異的總和，是生物進化和物種分化的基礎［13］。

3.1 黃顙魚的遺傳多樣性分析

本研究中5個江段群體的野生黃顙魚Cyt b基因序列的堿基組成分別為 A(27.7%)、T(27.4%)、C(31.0%)、G(13.8%)，其中G的含量顯著低于其他堿基的含量，表現出明顯的反G偏倚，顯示出細胞色素b基因的共同特征［14］，這也是線粒體DNA的一個特點［15］。與多數硬骨魚類相似［5］，堿基組成差異不大，分布比較平均。

右江 (YJ)群體的遺傳多樣性最高 (Hd=0.92038)，屬于高單倍型。將珠江水系的野生黃顙魚5個江段的群體作為一個整體，其Hd和Pi值分別為0.84857和0.04817，呈高單倍型、低核苷酸多樣性的分布模式，表明其遺傳多樣性相對中等。與鐘立強等［16］在研究長江中下游5個湖泊黃顙魚種群線粒體細胞色素b基因的遺傳變異分析中所得結果所示基本一致，黃顙魚的平均單倍型多樣性為0.945，核苷酸多樣性為0.00419，其結果均呈現黃顙魚的遺傳多樣性表現為中等水平。物種的遺傳多樣性的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關，遺傳變異是有機體適應環境變化的必要條件［17－18］。因此，加強對現有資源科學管理和保護、恢復有效種群大小、豐富遺傳多樣性是保護野生自然資源的基礎［19］。

3.2 黃顙魚的遺傳變異分析

遺傳多樣性是指生物種內和種間的遺傳變異度，是生物適應環境與進化的基礎［20］。物種對生存環境的適應能力以及其進化的潛力依靠種群內遺傳變異的大小，也依賴于遺傳變異的種群結構［21］。單倍型之間的遺傳距離是衡量一個物種或群體的mtDNA變異程度的重要指標［22］。研究表明，遺傳距離是衡量群體間遺傳變異程度的可靠參數，遺傳距離越大表明群體間親緣關系越遠。利用軟件MEGA5.0計算5個江段的野生黃顙魚各群體間和群體內的遺傳距離，其結果均在0.001～0.08之間，遺傳距離較小，則均顯示地理群體間有較近的親緣關系。

群體遺傳學認為，Fst值可以表示群體間的分化程度。根據Wright［23］提出的標準，一般指當0＜Fst＜0.05時表示分化較弱或者表示群體間無分化，當0.05＜Fst＜0.15時表示遺傳分化中等，如0.15＜Fst＜0.25時，則表示遺傳分化較大，而超過0.25表示遺傳分化極大或表明群體呈高度分化。本研究中，5個野生黃顙魚地理群體間的遺傳分化系數在0.02604～0.41430之間，都勻跟左江江段群體的遺傳分化程度最大，左江和右江江段群體的遺傳分化程度最小。左江和右江群體間的Fst值為0.02604，數值在0～0.05之間，表明2個江段野生黃顙魚種群間存在中等偏低的遺傳分化，不存在顯著的地理隔離現象。而都勻與左江的地理位置相對較近，遺傳分化程度卻最大，原因可能是由于都勻和左江流域之間有紅水河流域隔開，加之左江水電站的建立更加大了2個江段群體間野生黃顙魚的遺傳分化的原因。

基因流Nm通常被用來評價不同地理群體間基因交流的程度。Nm值的大小與2個群體間基因交流的程度呈正相關，即當Nm的值越大，表示2個群體間的基因交流頻繁，反之亦然。Wright認為:當Nm遠遠小于1，種群會被強烈的分化，表明2個群體間的基因交流有限，存在一定的地理隔離;當種群基因流系數Nm＞1時，種群間存在一定的基因流動，有較高的基因交流水平;如果Nm＞4，表明是2個群體是隨機交配，基因交流頻繁［24］。本實驗中，5個江段間黃顙魚的基因流系數Nm在范圍0.35342～9.35061之內，其中，都勻和左江江段群體間的Nm值最小，說明存在一定地理隔離，基因交流有限，而左江和右江群體間的Nm值最大，遠大于4，說明2個群體間基因交流頻繁，而且左右江的距離也是相對來說最近的，也驗證了地理位置是原因之一。黃顙魚是一種生態適應性很強的魚類，不同水系的居群借助于水系的連通而發生基因交流的可能性很大，5個江段的黃顙魚生境差異不明顯，在一定程度上為群體間的基因交流提供了有利條件，這可能是造成不同江段珠江流域間野生黃顙魚群體沒有明顯遺傳分化的原因之一。

3.3 黃顙魚的種群動態分析

本研究應用中性檢測來判斷種群是否經歷過擴張。應用Tajima's D與Fu's Fs值中性檢驗推測種群歷史時，如果Tajima's D與Fu's Fs值呈負值，且在統計學上達到顯著標準，則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化，可能預示著被研究種群曾經經歷過一個擴張的歷史［25］。

通過應用DNASP軟件分別對5個江段的野生黃顙魚Cyt b基因序列進行中性檢測，得到Fu's Fs值和Tajima's D值，結果表明，桂林和都勻2個江段的黃顙魚群體的Fu's Fs值是小于0且P值不顯著，Tajima's D檢驗D值小于0且P值不顯著，左江、右江群體Fu's Fs值是大于0且Tajima's D檢驗D值大于0，東江群體Fu's Fs值是大于0，Tajima's D檢驗D值小于0但P值不顯著，均表明群體沒有發生過種群擴張，種群數量相對穩定。

物種的遺傳多樣性反映了一個物種對環境的適應能力、生存能力和進化潛力，其遺傳多樣性越豐富，對環境的適應能力就越大，生存和進化的能力也越強。保護珠江及其流域內各支流和湖泊中魚類的遺傳多樣性是我國重要的漁業管理政策。根據本實驗結果顯示，珠江流域野生黃顙魚的遺傳多樣性處于相對較低的水平，已經達到亟需保護的狀態。所以，有必要提前采取適當的管理策略以維持其野生資源的可持續性開發以及維護不同水系間遺傳多樣性和原有的生態平衡。

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