小鼠胚胎顯微操作針的制作方法

倪萌萌+許厚強+趙佳福+陳偉+桓聰聰+周迪

摘要：顯微操作針是顯微操作的必備工具，其制作的好壞直接影響到操作的成敗。介紹了利用拉針儀、斷針儀、磨針儀制備用于小鼠胚胎移植顯微操作的移卵針（moving pipettes）、注射針（injection pipettes）和持卵針（holding pipettes）的制作方法，以供實驗參考。

關鍵詞：顯微操作;移卵針;注射針;持卵針;制作方法

中圖分類號： Q-336 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0226-03

收稿日期：2014-05-19

基金項目：貴州省科技重大專項（編號：黔科合重大專項字[2013]6008號）;貴州大學青年教師科研基金（編號：貴大自青基合字[2012]010號）

作者簡介：倪萌萌（1989—），男，安徽鳳陽人，碩士研究生，研究方向為動物繁殖生物技術。E-mail： 237805700@qq.com。

通信作者：許厚強，教授，博士生導師，研究方向為畜禽種質資源保存與創新利用。Tel：（0851）8292183;E-mail：

近20年來，DNA顯微注射技術已成為轉基因動物生產中基因轉移的重要手段。而顯微操作針是應用于輔助生殖[1]、動物克隆[2]、轉基因動物的制備[3]和嵌合體動物制備[4]等方面的重要工具之一。顯微操作的成功與否與顯微操作針制備的好壞密切相關。目前購買成品針用于顯微操作成本太高，許多領域的特殊操作用針只能通過人工拉制，因此，多數實驗室傾向于自制顯微操作針。目前大多選擇購買拉針儀、斷針儀和磨針儀等儀器設備，自行拉制顯微操作針，從而可以對顯微針的參數進行精確的控制，獲得理想的實驗用針。本研究通過日本尼康NT88-V3型倒置熒光顯微操作儀，總結出適合該設備系統的顯微操作針制備方法，以供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與材料

倒置熒光顯微操作儀（日本，尼康NT88-V3），水平拉針儀（日本，Narishige PN-30），磨針儀（日本，Narishige EG-44），斷針儀（日本，Narishige MF-900），微電極玻璃毛細管（外徑：1.00 mm，內徑：0.70 mm）和微電極玻璃毛細管（外徑：1.00 mm，內徑：0.66 mm），眼科鑷。

1.2 方法

1.2.1 制針用毛細玻璃管的準備 購買經過硅化的毛細玻璃管時，需檢查是否經過滅菌處理，多數商家提供的毛細玻璃管不用滅菌，拆開包裝就可直接使用，最好現用現拆，避免過早打開積累灰塵。但有些廠家的毛細玻璃管出廠前僅用75%乙醇處理，需要經過以下處理才能使用：4% HCl浸泡 24 h，除去沾在管壁的污質，自來水沖洗至中性，用去離子水沖洗后浸泡0.5 h，烘干，75%乙醇浸泡24 h，去離子水沖洗，烘干，包裝后160 ℃干烤滅菌2.5 h[5]。

1.2.2 移卵針的制作 雙手持住一根10 cm的玻璃管（外徑：1.00 mm，內徑：0.66 mm）兩端，將玻璃管的中部置于乙醇燈外焰，邊旋轉邊加熱，當玻璃管變軟時，迅速水平拉伸，回折至拉細處斷開，并在乙醇燈外火焰上快速拋光移卵針尖端 1～2 s，在體視顯微鏡下觀察針的尖端是否光滑，是否保持一定的內外徑。理想的移卵針內徑在150～200 μm之間為宜。使用時與口吸硅膠管連接。

1.2.3 注射針的制作 注射針的制備分5步：拉、斷、磨、拔、彎。

拉：使用水平拉針儀拉制。設定好拉針儀的3個參數：熱度、主磁力、副磁力，戴一次性乳膠手套將微電極玻璃毛細管（外徑：1.00 mm，內徑：0.70 mm）置于拉針儀“Ω”形鉑絲的中央，并擰緊兩邊的螺絲固定好。運行參數，將拉出的針坯用眼科鑷放置在準備好的塑料泡沫針板上，待用。

斷：使用斷針儀水平斷針。首先在100倍視野下，將電熱絲及事先制作好的玻璃珠調至最清晰的位置，將拉好的針插入持針器內，并將其水平放置在支撐架上，在鏡下調清針的位置，水平調節針的位置使其斷針處的位置位于玻璃珠的正上方，踩下踏板接通電源，緩慢調節溫度旋鈕使鉑金絲和玻璃珠微微發紅時（約45 ℃），將針靠近并緊貼，此時，針會有微小的擺動，說明針與玻璃珠開始熔化粘連，松開腳踏板，這時電熱絲和玻璃珠冷卻會產生向下的拉力將針斷開。此時針口將被斷成一個斷面，要求斷面垂直、平滑、干凈（圖1、圖2）。

磨：用磨針儀滴水磨針。將斷好的針插入持針器里，擰緊螺絲后固定在磨針儀上，調好角度45°～50°，調節升降旋鈕，使持針器緩緩下降至針尖與磨石的平面剛好接觸，在磨針儀的注射器內加適量的去離子水，使之均勻滴下，調節磨石的轉

速使水滴不被迅速甩掉為宜，這樣磨出的針比較干凈，6 min磨好1根。

拔：使用斷針儀垂直拔尖。首先在100倍視野下，將鉑金絲和玻璃珠調至最清晰的位置，將磨好的針插入持針器內，并將其垂直放置在支撐架上，在鏡下調清針并使針的位置位于玻璃珠的正上方，磨面正對操作者，踩下踏板接通電源，緩慢調節溫度旋鈕使鉑金絲略呈橘紅色（約50 ℃），緩慢下降針尖端，使其靠近玻璃珠并與之接觸，待針尖一接觸玻璃珠就迅速將針向上撤離，此時針尖被拉成一個短而銳利的尖，以利于穿刺進入卵母細胞胞漿膜。

彎：使用斷針儀水平彎針。把持針器調成水平放置，調清視野，針在玻璃珠的上方一段距離，踩下腳踏板接通電源，緩緩調節溫度，直至鉑金絲和玻璃珠呈橘黃色（約60 ℃），將玻璃珠緩緩向上面靠近玻璃針，同時觀察鏡中的標尺，達到所需要的角度（15°～20°）時，立即松開腳踏板，即成所需角度的注射針（圖3、圖4）。

1.2.4 持卵針的制作 持卵針制備分4步：拉、斷、燒、彎。

拉：同注射針拉針。

斷：同注射針斷針。endprint

燒：將已斷好針的斷面豎直或水平接近玻璃珠，相距 10 μm 左右，不可相互接觸，踩下踏板接通電源，并緩緩調節電熱絲的溫度（約60 ℃），鉑金絲和玻璃珠變橘黃色時，針管口內徑慢慢回縮，用目鏡中的顯微標尺觀察尖端內徑變化情況，直至內徑為15～20 μm時松開腳踏板停止加熱，將溫度旋鈕調回“0”位置。此時持卵針內徑大小合適，表面光滑（圖5、圖6）。

彎：同注射針彎針一樣，角度有所差別，一般在20°～30°較為適宜。

1.2.5 針的保存 若針管中有碎屑或灰塵，可用10%氫氟酸溶液沖洗5次，再用去離子水沖洗5次。將制作好的針存

放于75%乙醇清洗過的塑料盒中，固定存放。使用前用紫外線照射30 min 殺菌消毒。

2 討論與結論

轉基因小鼠的制作過程中包括許多關鍵步驟，而且每一步又有很多因素對轉基因小鼠制備的成敗產生影響，顯微注射是其中核心部分，除了顯微操作的速度、顯微操作的方法、培養液的成分、培養環境的溫度和pH值的穩定等因素[6]外，拉針儀、斷針儀相關參數設置，斷針、磨針所采取的不同方式及顯微操作針拉制的好壞都會影響轉基因實驗的成敗。

2.1 拉針儀相關參數設置對針坯的影響

筆者所在實驗室采用PN-30水平拉針儀（日本，Narishige）拉制顯微操作針，該儀器包括：heater（熱度）、magnet sub（副磁力）、magnet main（主磁力）3個參數，根據制備針的不同選擇不同的參數組合。熱度主要是對玻璃管進行加熱，熱度越高，針拉得越快、針尖越長、針尖的口徑越細，數值范圍一般在70～85之間。主磁力決定針尖的細度，數值越高針尖越細，數值范圍一般在65～100之間。副磁力是決定針尖細部的長度，數值越高針尖口長度越長，數值范圍一般在22～57之間。這些參數是相互影響的，拉制針時調節一個參數其余固定，找到一個最合適的參數，并固定下來。如熱度為85 ℃、主磁力為67.2、次磁力為23時，可拉制出長15～20 mm、內徑10 μm 左右的操作針。

2.1.1 鉑金圈的形狀對針坯的影響 拉針儀上的鉑金圈很重要，其形狀如“Ω”形，表面要光滑呈圓弧形，如出現任何不規則的形狀都會影響拉制針的形狀。所以用眼科鑷取出拉制好的針坯時，要特別小心，不可觸碰到鉑金圈，避免外力改變其形狀，導致后續的工作無法正常進行。放置毛細玻璃管時，要固定在鉑金圈的中央，不接觸到其任何一邊，固定時要擰緊螺絲旋鈕，同時同向旋鈕，防止拉制時一邊沒固定好拉不斷毛細管，從而導致受熱不均，拉力不均，拉不出高質量的針坯，此時的針尖端易彎翹、扭曲，影響使用。

2.1.2 鉑金絲上玻璃珠的位置、大小對注射針和持卵針拉制的影響 鉑金絲上玻璃珠的最佳位置是向上有個凸起、外徑80 μm左右為宜（圖7），玻璃珠太大或太小都易使針彎而不斷。玻璃珠往往在煅燒時容易熔化下垂，在鉑金絲下方出現凸起（圖8）或者鉑金絲上沒有玻璃珠（圖9），這2種情況都是不合適的，在斷針、燒針、彎針時容易受熱不均，導致針尖端的不平、針管的變形、針彎而不斷等，拉不出質量好的針胚，影響使用。

2.2 斷針儀上不同處理方式和溫度選擇對顯微操作針拉制的影響

2.2.1 斷針方式及溫度控制對注射針和持卵針拉制的影響 使用斷針儀斷針方式分為水平斷針和垂直斷針2種，經實踐比較，水平斷針效果優于垂直斷針，垂直斷針因看不見玻璃珠和針管的接觸情況，往往會出現視野內斷得較直，但是旋轉至水平后卻發現針是彎的。相比之下水平斷針就能避免這樣的問題，它能很好地看清玻璃珠與針管的接觸情況，在視野里能一目了然地觀察斷針情況。 較適宜斷針的溫度應為鉑金絲和玻璃珠微微發紅時（約 45 ℃）。溫度過高易使針管熔化粘連在玻璃珠上，而且斷的針尖端容易不平整、扭曲;溫度過低則無法把針拉斷。

2.2.2 拔尖的方式及溫度對注射針拉制的影響 拔尖采用水平拔尖或垂直拔尖皆可，要求針尖磨面正對操作者，針與玻璃珠要完全垂直，這樣拔出的尖才不會彎斜。 較適宜拔尖的溫度應為鉑金絲和玻璃珠略呈橘紅色（50 ℃左右）。溫度過高針尖拔得太細長、針口易皺縮熔化乃至封口;溫度太低，針尖拔得很短、不銳利乃至拔不出尖，還易把針拔斷。

2.3 磨針方式對注射針拉制的影響

使用磨針儀磨針的方式有2種：一種是加水磨針，一種是不加水磨針。經過實踐比較，加水磨針效果優于不加水磨針。不加水磨針，時間較快，但是針管內會粘上玻璃碎屑和灰塵，需用氫氟酸和超純水清洗才能使用，比較麻煩;加水磨針，時間相對慢點，但磨出的針較干凈、可直接使用。

2.4 顯微操作針的評定標準

2.4.1 注射針 拉制的針應長5～8 cm，才能保證有適宜的注射用尖端。最好的注射針尖端的直徑應小于1 mm，內徑在10～12 μm之間。在光學顯微鏡下無法看清，如果能在光學顯微鏡下看清注射針尖端的開口，則說明針尖端開口直徑過大，注射針開口太大則刺入原核就會很困難，注射后更多的受精卵會裂解;但是，如果開口太小，粉塵堵塞針尖的可能性就會增大。哪種大小的針最佳，必須要試不同規格的注射針以確定哪一種是最合適的。另外一個重要的參數即針尖部的錐度，這可以通過測量針的距尖端固定距離處的直徑來估計。在距注射針尖端50 μm處的直徑應為10～15 μm或更小。注射針的肩部到尖端的距離應為5～8 mm。Jeffrey等研究表明8 mm是最佳的[7]。如果這個距離過小，注射針的肩部會使針的尖端在注射小室的底部無法固定，從而影響注射的效果;如果針太長，注射時注射針在穿過厚的礦物油層時容易不穩固而彎曲，從而導致注射失敗[8]。

2.4.2 持卵針 管尖端外徑和卵母細胞直徑相差不應超過10～30 μm。管口中央與卵母細胞中央應在同一水平線上，這樣在固定卵母細胞時就不會發生垂直方向上卵母細胞的運動。管口外徑不宜太大，否則卵母細胞不易按要求固定。在被固定前，垂直方向上的位置變動會導致極體位置變化。如果管口外徑太小，在去核時卵母細胞往往擺動，影響操作。持卵針內徑開口在中間為最佳。要做到這一點，必須保持斷端平齊。理想形狀的固定針應是外徑100～120 μm、內徑10～20 μm，兩邊對稱并光滑[9]。endprint

2.4.3 移卵針 針管斷面要求平齊、均一、光滑。拉制好的移卵針的外徑應為150 μm，略大于受精卵的透明帶直徑。

參考文獻：

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[9]馬育芳，呂自力，王小寧，等. 顯微操作針的制作[J]. 黑龍江動物繁殖，2004，12（1）：46-47.endprint