促進種子萌發的重樓內生菌的篩選

宋發軍,于鵬飛,劉 佳,席曉圓,趙盛英,張 鵬

(中南民族大學 生命科學學院, 生物技術國家民委重點實驗室/武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

促進種子萌發的重樓內生菌的篩選

宋發軍,于鵬飛,劉 佳,席曉圓,趙盛英,張 鵬*

(中南民族大學 生命科學學院, 生物技術國家民委重點實驗室/武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

通過比較60株重樓內生細菌發酵液的水相提取液和有機相提取液對冬小麥種子萌發的影響，發現8株細菌的有機相提取物具有促萌發作用.將其中4株細菌的發酵液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，蒸干物用甲醇溶解并稀釋成不同濃度處理冬小麥種子.結果表明：腸桿菌屬74#菌的石油醚相提取物、不動桿菌屬108#菌的氯仿相提取物、芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏桿菌屬149#菌的乙酸乙酯相提取物的促萌作用較強(p<0.05)；其中芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌作用最強(p<0.01).

重樓內生菌；冬小麥種子；萌發；提取物

植物內生菌是一類多樣性豐富的微生物類群，常生活在健康植物的各種組織和器官內部的細胞或細胞間隙內，一般不引發宿主植物明顯感染.早在19世紀已分離得到內生菌[1,2]，但目前，內生菌的價值和作用并未獲得深入的研究和應用[3,4].內生菌對植物的生長有重要影響，如感染內生菌的植物一般較未感染的植株生長更快，且人工接種某些內生菌還能提高植物存活率，促進發芽[1,2,5].

許多重要的藥用經濟植物具有顯著的種子休眠特征，如重樓、圓柏種子等休眠時間長，從播種到出土成苗需要約2年，是典型的“2年種子”[6].通過篩選能促進種子萌發的內生菌，利用其打破藥用植物種子的休眠，可為藥用植物的快速繁育奠定基礎.本文以冬小麥種子為對象，分離重樓內生菌的發酵液提取物并處理冬小麥種子，篩選可促進種子萌發的內生菌，并對菌株進行了初步分類鑒定，為獲得可有效打破種子休眠、促進種子萌發的內生菌及其產物的研究提供了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

冬小麥種子、重樓內生菌由中南民族大學生命科學學院提供，甲醇、無水乙醇、氯仿等(國藥集團化學試劑有限公司)，恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠).

1.2 重樓內生菌的分離和發酵液提取物的制備

參照文獻[7]，將重樓塊莖削除外皮后， 用0.1%升汞溶液處理5 min，75%酒精處理5 min，滅菌水清洗后，在超凈工作臺上切成1 cm2左右的小塊，接植在LB固體培養基平板上，室溫培養7d.每日觀察，將長出的細菌分別挑至新的LB固體培養基平板上純化后進行保種.將分離的內生菌接種于100 mL LB培養基中，37 ℃、190 r/min搖床培養7d后，超聲破碎10 min，5000 r/min離心15 min并收集上清液，即為發酵液[8].

1.3 促萌發內生菌的初篩

將發酵液用等體積氯仿萃取，分別得有機相和水相，用旋轉蒸發儀分別蒸干水相和有機相.蒸干后水相固體用超純水定容至30 mL，有機相固體用1.5 mL分析純甲醇溶解，超純水定容至30 mL備用[9].冬小麥種子經適量的滅菌水于37 ℃恒溫浸種12 h后，均勻放置在鋪有濾紙的培養皿中[10]，把不同內生菌發酵液提取物加到對應編號的培養皿中處理冬小麥種子，培養條件為：室溫、暗培養.以含5%甲醇的超純水處理做對照，并參照文獻[8]，在第3, 5, 7 d觀察和統計冬小麥種子的發芽率.

1.4 促萌發內生菌的復篩

將初篩獲得的菌株的發酵液，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(極性由小到大)進行萃取得有機相萃取液，蒸干后分別用1.5 mL甲醇溶解，超純水定容至30 mL，分別得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取液原液，再用含5%甲醇的超純水分別進行1/2、1/5梯度稀釋.將提取液原液和稀釋液依據1.3的方法處理冬小麥種子，以含5%甲醇的超純水處理做對照.每個濃度的處理實驗進行3個平行重復，并在第3, 5, 7 d觀察并統計冬小麥種子的發芽率.

2 結果

本文從重樓塊莖共分離、純化獲得60株形態有差異的細菌.將其發酵液提取物分別處理冬小麥種子，結果(見表1)表明：不同內生菌發酵液的水相提取物均不能促進冬小麥種子的萌發，甚至存在一定的抑制作用，故復篩時不再對水相提取物進行實驗；而有機相提取物具有促進冬小麥種子萌發的能力，其中74#、108#、114#、136#、138#、139#、147#、149#菌株的有機相提取物具有較明顯的促萌發作用(p<0.05)，在3, 5, 7 d檢測點的萌發率明顯高于其他菌株及對照處理(p<0.05).

表1 促進冬小麥種子萌發的內生菌的初篩結果

對初篩的8株菌進行了基因組DNA的提取和16S rDNA的擴增及測序分析，結果表明：74#、114#、139#菌株屬于腸桿菌屬(Enterobactersp.)，108#菌屬于不動桿菌屬(Acinetobactersp.)，136#、138#、147#菌屬于芽孢桿菌(Bacillussp.)，149#菌屬于克雷白氏桿菌屬(Klebsiellasp.).

從4個菌屬中各選取一株促萌效果最好的菌株：74#、108#、138#、149#進行復篩，結果(見表2)表明：74#菌落的石油醚相提取物(3, 7 d最大發芽率70%, 85%)，108#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大發芽率71%, 83%)，138#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大發芽率76%, 80%)，149#菌落的乙酸乙酯相提取物(3, 7 d最大發芽率62%, 86%)促萌發作用較強(p<0.05).各個有機相提取液的1/2稀釋液比原液和1/5稀釋液的促萌效果更好(p<0.05)： 3 d萌發率高出4%～38%； 5 d萌發率高出21%～29%； 7 d萌發率高出22%～28%.以3 d時的數據作為主要依據可見，138#菌株的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌發作用最強(p<0.01, 見圖 1).

表 2 4株菌發酵液的4種有機相提取物對冬小麥種子萌發率的影響

注：PEE(petroleum ether extract):石油醚萃取物; CE(chloroform extract): 氯仿萃取物; EAE(ethyl acetate extract):乙酸乙酯萃取物; NBE(n-butanol extract): 正丁醇萃取物

-1：石油醚相提取液; -2：氯仿相提取液; -3：乙酸乙酯相提取液; -4：正丁醇相提取液**與CK(含5%甲醇的超純水處理)相比, p<0.01圖1 在3 d時 74#、108#、138#、149#菌株發酵液有機相提取物的1/2稀釋液對冬小麥種子的促萌效果Fig. 1 The promotive effcet of the half dilution of the organic phase solution extracted from the fermentation broth of strain 74#、108#、138#、149# on the germination of winter wheat seeds on the third day

3 結論

(1) 通過比較60株菌發酵液水相提取物和有機相提取物的處理結果，發現不同內生菌發酵液的水相提取物均不能促進冬小麥種子的萌發，而有機相提取物對冬小麥種子萌發具有促進作用，推測促萌發物質居于有機相.

(2) 通過比較4株不同屬細菌的發酵液的有機相提取物對冬小麥種子萌發的影響，發現不同屬內生菌的有機相提取物的促萌發能力不同，腸桿菌屬74#的石油醚提取物、不動桿菌屬108#的氯仿提取物、芽孢桿菌屬138#的氯仿提取物、克雷白氏桿菌屬149#的乙酸乙酯提取物的促萌發作用較強.

(3) 通過比較3d時不同稀釋度的提取液對冬小麥種子的促萌發作用，發現138#菌落的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌發作用最強.

[1] Strobel G A. Endophytes as sources of bioactive products[J]. Microbes Infect, 2003, 5(6):535-544.

[2] Strobel G A. Rainforest endophytes and bioactive products[J]. Crit Rev Biotechnol, 2002, 22(4):315-333.

[3] 楊勝遠,陸兆新,孫力軍,等.產谷氨酸脫羧酶金銀花內生菌的鑒定及其轉化特性研究[J].食品科學,2007,28(2):196-201.

[4] 馬同鎖, 袁紅樓, 趙士豪. 油菜種子內生菌的去除及對萌發率的影響[J].中國農學通報,2012,28(24): 31-34.

[5] Cheng Kun,Yang Yanqiong,Zhao Changling,et al. Isolation of the endophytic fungi ofParispolyphallavar.yunnanensis and their effects on the embryo development ofP.polyphyllavar.yunnanensisseeds[J]. Agricultural Science & Technology,2012,13(7):1497-1501,1570.

[6] 黃 瑋, 孟繁蘊, 張文生, 等.滇重樓種子休眠機理研究[J].植物生理科學,2008,24(12):242-246.

[7] 莊紅玲.基于植物內生菌代謝產物篩選生物活性物質[D].昆明：昆明醫科大學, 2013.

[8] 孫紅敏.促進和抑制小麥萌發生長中草藥的篩選及其有效成分分離、鑒定[D].雅安:四川農業大學, 2012.

[9] 洪宗國，張令令，吳煥淦.不同采集期艾葉正構烷烴成分和含量分析[J].中南民族大學學報：自然科學版，2014，33(1)：41-44.

[10] 嚴海燕，Murphy J B，張豐瑞.萌發中食松幼苗貯藏物質的利用和變化[J].中南民族大學學報：自然科學版，2007，26(3)：14-18.

Screening ofPolyphyllaEndophytes with Germination Effect

SongFajun,YuPengfei,LiuJia,XiXiaoyuan,ZhaoShengying,ZhangPeng

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, National Committee Key Laboratory for Biotechnology/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,Wuhan 430074, China)

The effect of the aqueous and organic extracts of the fermentation broths of 60Polyphyllaendophytic bacteria on the germination of winter wheat were compared. The organic extracts of 8 endophytes had germination effect and four fermentation broths from them were then extracted by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate andn-butanol, respectively. The dried product was dissolved with methanol and diluted into different concentrations to treat the winter wheat seeds. The results showed that the petroleum-ether extract fromEnterobactersp. 74#, the chloroform extract fromAcinetobactersp. 108#, the chloroform extract fromBacillussp. 138#and the ethyl acetate extract fromKlebsiellasp. 149#had significant germination effect (p<0.05). The 1/2 dilution of the chloroform extract fromBacillussp. 138#had the best germination effect (p<0.01).

Polyphyllaendophyte; winter wheat seeds ; germination; extract

2014-10-07 *通訊作者 張 鵬(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：藥用植物及其內生菌, E-mail: zhangpenghust@126.com

宋發軍(1967-)，男，教授，研究方向：應用生物化學, E-mail:songfajun@scuec.edu.com

國家自然科學基金資助項目(31370118)，中南民族大學2014年碩士研究生學術創新基金(2014sycxjj112)

Q939.96

A

1672-4321(2015)03-0029-04