植物體細胞胚發生miRNA研究進展

許珊珊　林思祖

摘要介紹了植物miRNA的作用機制，并重點闡述了落葉松、玉米、龍眼體細胞胚發生相關miRNA的研究進展。隨著miRNA的深入研究，體胚發生相關miRNA的功能驗證、不同miRNA間的相互調控及對下游靶基因的調控作用研究將成為重要的研究方向，因此，了解植物體胚發生miRNA的發展現狀及趨勢非常重要。

關鍵詞體細胞胚發生；miRNA；落葉松；玉米；龍眼

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-018-03

植物體細胞胚的概念源于1902年Haberlandt提出的植物細胞具有全能性，即每一個細胞都能不斷分裂，進而分化形成完整的植株[1]。有關植物體細胞胚發生的研究最早是從胡蘿卜貯藏根組織培養材料中觀察到來自體細胞組織胚的啟動和發育過程[2]。同時，由于體細胞胚發生過程與合子胚發育高度相似[3]，且其在離體條件下可人為控制收集特定發育階段的大量材料，因此體細胞胚發生亦是研究植物胚胎發育的模式系統。目前，已有眾多學者對體細胞胚發生的分子機理進行了大量研究，并分離出許多相關基因，但由于體細胞胚發生是個復雜的生物學過程，涉及一系列信號轉導過程和基因表達[4]，且其發生過程中各階段基因激活與抑制的潛在機制尚不清楚，仍不足以闡明胚胎發生機理和解決生產問題。

miRNA是一類長為21～24 nt內源的非編碼的小分子RNA，廣泛分布于植物基因組中。miRNA主要通過引導靶基因mRNA降解、介導翻譯抑制和介導DNA甲基化等途徑負向調節植物基因表達[5-9]，從而調控植物細胞分裂、組織分化、器官形態建成、激素應答與信號傳導以及植物對逆境脅迫的應答[10-16]。近年研究發現，miRNA作為上層調控因子在植物體細胞胚發生過程中同樣起著重要的調控作用[17]。筆者簡要介紹了植物miRNA的作用機制，并主要從落葉松、玉米、龍眼等植物闡述體細胞胚發生相關miRNA研究進展。

1植物miRNA的作用機制

1.1miRNA對靶基因的剪切

miRNA 介導的靶基因剪切是其主要的作用形式，一般而言，miRNA對完全互補或接近完全互補的mRNA序列進行切割。研究表明，這種切割通常精確地發生在miRAN配對堿基的第10和11位[18]。如果miRNA合成途徑中hen1、ago1、hyl1等關鍵基因發生突變會顯著降低miRNA的含量，影響其剪切作用，導致靶基因mRNA含量升高[19-21]；相反miRNA過表達則引起靶基因mRNA的減少。

1.2miRNA的翻譯抑制作用

在動物中，當RISC復合體中的單鏈miRNA與3′UTR不完全互補時，會通過阻斷該基因的翻譯過程，從而調節基因的表達。這種方式只影響蛋白的表達水平，并不影響mRNA的穩定性。目前，有關翻譯抑制作用的相關報道主要見于動物中，而植物中的相關報道較少。研究表明，植物miR172可以影響靶基因AP2蛋白的積累，但不影響mRNA含量[22]。但最近研究表明，miR172對AP2的調控作用主要以剪切為主，只是低AP2濃度可以刺激AP2基因的表達[23]。因此，有關植物miRNA的翻譯抑制作用有待進一步深入研究。

1.3miRNA與轉錄沉默

miRNA可通過影響DNA水平的甲基化或者組蛋白進而影響基因轉錄[24-25]。研究表明，抗miR166的PHB基因在擬南芥中過表達可以導致PHB編碼區DNA的甲基化程度降低，且只有突變PHB基因植株會受此影響，野生型則不受影響。目前，這種發生在基因編碼區3′端的甲基化模式對PHB的轉錄有何影響尚不明確[8]。

2miRNA與植物體細胞胚發生

關于miRNA在植物體細胞胚發生過程中生物合成途徑的早期研究主要集中于比較miRNA在分化與未分化組織中的差異[26-27]。Luo等[26]從水稻分化和未分化的胚型愈傷組織中分離出31個miRNAs。其中，miR398在未分化的胚型愈傷組織中特異表達，而miR156在胚型愈傷組織從未分化狀態向分化狀態轉變過程中，表達水平顯著提高。通過對它們的靶標進行分析得出miR398和miR156調控的靶標分別為漆酶和SBP域結合蛋白，因此推測miRNA可能參與調節高度增殖的未分化細胞的維持，而不是朝著充分發育的體細胞胚方向分化。此外，在完全分化的體細胞胚中，胡蘿卜AGO1基因的表達隨著2，4-D的逐漸消耗表現出迅速上升然后又下降到幾乎檢測不到的變化規律，而AGO蛋白家族的存在對miRNA調控靶基因的表達是必須的，這表明在體細胞胚發生過程中miRNA的合成受到嚴格的調控[27]。

目前，有關植物體細胞胚發生相關miRNA的報道較少，僅有落葉松、龍眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等。而這些研究大都是采用高通量測序的方法來比較分析胚性與非胚性愈傷組織及體細胞胚發生過程中特異表達的miRNAs。

2.1miRNA與落葉松體細胞胚發生

落葉松是針葉樹的典型代表，其在體細胞胚方面的研究領先于其他針葉樹種。Zhang等[28]比較了日本落葉松胚型和非胚型愈傷組織miRNA表達譜，發現共有165個miRNA有差異性表達，分別屬于4個miRNA家族。其中，在胚型愈傷組織中miR171表達上調，miR159、miR169和miR172表達下調。這4個miRNA家族都屬于非生物脅迫誘導，且它們所有的目標轉錄因子都調控與細胞分化和發育關系密切的基因，包括由miR171調控的scarecrow-like（SCL）轉錄因子、miR172調控的apetala2轉錄因子、miR159調控的MYB轉錄因子和miR169調控的NF-YA轉錄因子。愈傷組織中3個表達下調的miRNA家族同時受ABA調控，進一步揭示了日本落葉松胚性能力轉化的潛在機制。在落葉松體細胞胚胎發育過程中發現了87個miRNAs，29個為針葉樹特異的，來自12個家族，分別為miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、nfiR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704，而其調控的34個靶基因可能參與生長發育、抗病、AGO反饋調節等多方面遺傳調控。在此過程中，72%miRNAs表達次高峰在后期單胚或早期子葉胚，在中期子葉胚最低，最高峰在后期子葉胚，分別與子葉形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活動相吻合。miR397和miR408表達次高峰在PEMIII，而miR398在早期單胚，miRl56和miRl66在早期子葉胚，表明其與保持薄細胞壁、質子傳遞、頂端分生組織形成等調控有關[29-30]。相應的truncated分析表明，落葉松體胚發生過程中miRNA可以從兩端降解，66%miRNA從3′-5′降解的頻率高于5′-3′方向，且不同miRNA家族或同一家族不同成員間miRNA降解頻率不同，說明落葉松miRNA降解受到復雜機制調控。miRNA異構體分析表明miRNA存在3′端腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶核苷酸添加現象，體胚中miRNA位點傾向于加C；miR397a和llemiR-7在體胚發育過程中isomiR-C較豐富，說明特異miRNA3端胞嘧啶添加在植物生長發育過程中具有生物學意義[31]。

在miRNA靶基因方面，Li等[32-33]從日本落葉送體胚中成功分離了miR159的靶基因LaMYB33、miR171靶基因LaSCL6。

2.2miRNA與玉米體細胞胚發生

在玉米胚型愈傷組織誘導過程中共檢測到20個差異表達miRNA保守家族，共有78個差異表達miRNA，其中包括13個保守家族新成員，分別屬于zma-miR528、zma-miR172、zma-miR167、zma-miR319、zma-miR393、zma-miR396、zma-miR397和zma-miR408 8個保守miRNA家族。RT-qPCR分析結果顯示，除miR1671和miR827表達下調，其余11個miRNA均表達上調。通過降解組測序得到213個靶基因，可分為細胞組成、分子功能和生物過程3類，分別參與調節植物生長發育、轉錄調控、脅迫響應、激素信號傳導和植物代謝途徑等過程。其靶基因功能主要涉及SBP、TCP、GAMYB、ARF、F-boc和GRAS等轉錄因子。姚霞冬[34]研究表明，激素信號轉導途徑與玉米胚性愈傷組織形成顯著相關，而zma-miR160、zma-miR167、zma-miR393和zma-miR394等調控的14個靶基因在該通路中表達。

2.3miRNA與龍眼體細胞胚發生

利用Solexa 測序技術從龍眼體胚發生過程中得到了Unique序列6，553，782條，其中包含367個已知的龍眼miRNAs，與其他物種相比[35-38]，獲得的已知miRNAs 數量較多，說明龍眼體胚發生過程中擁有種類豐富和數量較多的miRNA 家族。龍眼體胚發生過程中sRNA 主要以24 nt 的長度為主，miRNA 的表達豐度存在巨大差異，只有少數miRNA家族大量表達，絕大部分miRNA均為低豐度表達；經過分析獲得了23 個候選的新miRNA，其中有10 個miRNA 含單個基因座，另外13 個miRNA 15 具備多個基因座。同時，鑒定得到調控DlSODs的11個dlo-miRNAs，它們以裂解DlSODs mRNA的方式調控其在龍眼體胚發生過程中的轉錄后水平表達。這11個dlo-miRNAs分別是dlo-miR156（靶標DlCSD1a）；dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643（靶標DlCSD1b）；dlo- miR159、398、1171a和1171b（靶標DlCSD2a）以及dlo-miR808和2089（靶標DlFSD1a），它們在龍眼體胚發生過程中呈較大差異表達。龍眼體胚發生早期的形態建成主要是由dlo-miR3，5，10，12，13，156a，156c，397a，398b.1，398b.2，398b.3，808和2089*等miRNA共同介導的，它們均在體胚發生早期球形胚之前大量表達，晚期表達量多數下降，部分miRNA甚至不表達；dlo-miR6、160a和167a可能在龍眼體胚發生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a轉錄水平的累積對龍眼心形胚和魚雷形胚的形態建成可能是必須的；dlo-miR167a在龍眼子葉胚和成熟胚中起主要作用；而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龍眼體胚發生過程中的表達均較穩定。這說明miRNAs表達的組織和時空特異性共同介導了龍眼體胚的發生[39-40]。

利用RT-PCR技術，從龍眼胚性愈傷組織中獲得了4條miRNA的初級體序列，分別命名為dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a，大小分別為254、751、560、228 bp。生物信息學分析表明，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a均含有miRNA典型的二級結構，且它們二級結構自由能遠高于一般植物的平均自由能；系統發育樹顯示，dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR397a與擬南芥同源性很高，dlo-pri-miR166a與甜橙有很高同源性；此外，利用psRNA Target 程序預測出miR156a-1、miR156a-2、miR166a、miR397a靶基因[41]。

對龍眼體胚進行外源激素及非生物脅迫處理，發現dlo-miR156a、dlo-miR397a及其靶基因dl-β-tubulin3、dl-β-tubulin6均有不同的表達模式，而dlo-miR166a在整個外源激素及非生物脅迫處理過程中均未表達。dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2、dlo-pri-miR166a、dlo-pri-miR397a初級體超表達研究表明，成熟dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a表達量均增加，且對于不同長度dlo-pri-miR156a-1、dlo-pri-miR156a-2，成熟dlo-miR156a表達量也有很大差異[41]。

3展望

植物體細胞胚作為研究植物胚胎發育的模式系統，其發生機理一直是研究熱點。miRNA作為轉錄后負調控因子在植物體胚發生過程中具有重要的調控作用。目前有關植物體胚 miRNA調控作用的報道較少，僅有落葉松、龍眼、水稻、甜橙、玉米和棉花等，但這些研究也僅限于體胚miRNA 的分離與鑒定，未對miRNA在體胚發生過程中的作用進行系統研究。因此，應進一步加強體胚發生相關miRNA的功能驗證、不同miRNA間的相互調控及對下游靶基因的調控作用研究，將有助于進一步闡明miRNA在植物體胚發生過程中的作用機制。

安徽農業科學2015年

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