硫酸軟骨素裂解酶ABC的研究進展

李曄，陳振婭，袁其朋

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硫酸軟骨素裂解酶ABC的研究進展

李曄1*，陳振婭2*，袁其朋2

1 北京電子科技職業學院生物工程學院，北京 100029 2 北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029

李曄, 陳振婭, 袁其朋. 硫酸軟骨素裂解酶ABC的研究進展. 生物工程學報, 2015, 31(5): 621–633.Li Y, Chen ZY, Yuan QP. Research progress in chondroitinase ABC. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 621–633.

糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，是由己糖與糖醛酸通過β-1,3糖苷鍵連接形成的線性多糖，分布于細胞外基質和表面，指導如細胞增殖、信號傳輸和炎癥介導等許多生物過程。糖胺多糖的大分子量，使得其很多功能都不能有效發揮，硫酸軟骨素裂解酶ABC (Chondroitinase，ChSase ABC) 作為一類多糖裂解酶解決了這一難題。本文結合我們的工作全面綜述了ChSase和ChSase ABC的分類，ChSase ABC的晶體結構及目前的研究進展。從ChSase ABC的特點出發，分析了ChSase ABC的分離純化方法、穩定性和固定化現狀以及國內外工程菌構建的研究進展。最后，總結了ChSase ABC目前研究中存在的問題，并展望了ChSase ABC的發展前景。

ChSase ABC，性質，生產，應用

糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，主要分布在細胞外基質和細胞表面，用來指導很多生物過程，如細胞增殖、信號傳輸和炎癥介導等[1-3]。硫酸軟骨素 (Chondroitin sulfate，CS) 是糖胺多糖的一種，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過β-1,3糖苷鍵相結合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類大分子多糖，雙糖單位數目一般在50–70個，分子量約在5–50 kDa之間 (圖1)。CS在軟骨的細胞外間質中存在，并以O型糖肽鍵或N型糖肽鍵與核心蛋白的絲氨酸結合[4]。由于CS含有羧基和硫酸基，CS還是一種酸性多糖[5]。

根據CS的結構及分子量的不同，將天然來源的CS分為A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等[6]。常見的為CS A、B和C，CS A又稱4-硫酸軟骨素，硫酸基在氨基半乳糖的第4位C上 (圖1)。CS B又稱硫酸皮膚素，與CS A是異構體。CS C又稱6-硫酸軟骨素，硫酸基在氨基半乳糖的第6位C上[7-8]。由于CS的分子量大，生物利用度低，在治療脊柱損傷、軸突再生、抑制腫瘤發生等方面使得其很多功效不能得到有效的發揮，很多研究表明酶法制備低分子量的CS可以有效克服以上缺點，因此制備低分子量的CS具有重要意義[9-10]。硫酸軟骨素裂解酶 (Chondroitinase，ChSase) 是一類能將CS、軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖及寡糖的裂解酶[11]。目前，國內外有許多公司銷售ChSase ABC，Sigma公司銷售價格為414.18元/U，思清源公司銷售價格為400元/U，主要用來檢測CS含量。本文主要介紹了ChSase及ChSase ABC的分類和性質，ChSase ABC的晶體結構，ChSase ABC的分離純化方法及重組菌的研究，分析了ChSase ABC作用、功效以及穩定性和固定化方面的研究進展，探討并展望了ChSase ABC研究存在的問題及發展前景。

1 CHSase性質及分類

ChSase是一類能將糖胺聚糖催化裂解為小分子多糖的酶[12]，ChSase根據其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等類型，如表1所示。ChSase作為一種研究機體蛋白聚糖結構與功能的工具和一種新型藥用酶日益受到人們的重視，2014年Makris等[13]將ChSase ABC、TGF-β1和賴氨酰氧化酶聯合使用來治療纖維軟骨損壞后的功能修復，結果發現界面抗拉剛度和強度較未經ChSase ABC處理的軟骨組織分別增加了730%和745%。Chen等[14]發現ChSase ABC可以使腦梗死后的神經再生，同時還可以抑制腦梗死的發生。Siebert等[15]發現ChSase ABC在治療脊柱損傷過程中，可以顯著提高軸突再生。

圖1 硫酸軟骨素基本單元

表1 ChSase的分類及作用底物

肝素黃桿菌中的ChSase AC和ChSase B酶活性和底物特異性已經被闡明[16-17]。ChSase B的晶體結構和共晶結構表明了它與底物的結合位點，ChSase B也是鈣依賴的裂解酶[16,18-19]。ChSase AC的晶體結構表明，其有與底物結合的特殊位點[17]。由于ChSase C的作用底物有限，目前有關ChSase C的報道還很少。

2 ChSase ABC簡介

硫酸軟骨素裂解酶ABC (Chondrotinase ABC，ChSase ABC) 是研究糖胺多糖結構的工具酶[20]。普通變形桿菌是ChSase ABC的主要來源，ChSase ABC分為ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ(EC 4.2.2.4)。兩種酶對相同的底物有不同的作用位點，催化時具有不同的動力學參數[11,21-23]。這兩種酶已經在先前的報道中被純化和研究。Prabhakar等[22-23]克隆得到ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ的編碼基因，并成功在大腸桿菌中表達，同時測定了該酶的活性和最佳反應條件。筆者所在的實驗室從(KCTC 2579) 中成功克隆到ChSase ABCⅠ的基因序列，在中表達，獲得可溶性的ChSase ABCⅠ，并對重組酶進行分離純化，后對其酶活、比酶活及動力學常數等進行了測定[24]。

2.1 ChSase ABCⅠ和Ⅱ的基本性質

ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ的分子量，分別為100 kDa和105 kDa[21]，ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ都含有大量Asn、Gln和Leu，兩個酶的N端氨基酸主要由Ala和Leu構成。DNA結構分析表明，ChSase ABCⅠ基因含有 3 063 bp的開放閱讀框架，其中含有72 bp的前導肽序列，編碼成熟后將切去24個氨基酸的前導肽序列[25]，ChSase ABCⅡ基因含有2 973 bp的開放閱讀框。

酶學基本性質顯示，當以CS C為底物，ChSase ABCⅠ測定溫度37 ℃，緩沖液為40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，ChSase ABCⅡ測定溫度40 ℃，緩沖液與ChSase ABCⅠ相同，ChSase ABCⅠ催化效率比ChSase ABCⅡ高，ChSase ABCⅠ的m比ChSase ABCⅡ低，max比ChSase ABCⅡ高[21]，具體數據如表2所示。

研究表明，對于不同的底物，測定溫度為37 ℃，緩沖液為40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，以CS A為底物時，ChSase ABCⅠ比酶活為400 U/mg，ChSase ABCⅡ比酶活為25 U/mg。以CS B為 底物時，ChSase ABCⅠ比酶活為180 U/mg，ChSase ABCⅡ比酶活為23 U/mg。以透明質酸為底物時，ChSase ABCⅠ比酶活為3 U/mg，ChSase ABCⅡ比酶活為5 U/mg。因此，對于不同的底物，ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ的催化活性有顯著的差異?？傮w來說，ChSase ABCⅡ催化活性比ChSase ABCⅠ低[21]。筆者所在的實驗室比較來源于的ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅡ的酶活及比酶活，發現在一定實驗條件下，ChSase ABCⅠ的總酶活達到3 180 U/L發酵液，與國內報道的最高水平2 000 U/L發酵液[26]相比高出1 180 U/L發酵液，發酵液經過分離純化后比酶活為76 U/mg，純度達到90%。而相同條件下檢測不到ChSase ABCⅡ的酶活，該結果與ChSase ABCⅡ在中的表達量及催化活性都比ChSase ABCⅠ低的結論相符[24]。

表2 ChSase ABCⅠ和Ⅱ的基本酶學性質

2.2 ChSase ABCⅠ和Ⅱ的晶體結構

ChSase ABCⅠ由997個氨基酸殘基構成，ChSase ABCⅡ由990個氨基酸殘基構成[21]。通過重原子置換法 (Multiple isomorphous replacement，MIR) 和多波長反常散射法 (Multi-wavelength anomalous diffration，MAD) 技術分析，ChSase ABCⅠ在1.9?的分辨率下R因子和自由R因子分別為0.157和0.214，具有很好的立體化學性，晶體結構如圖2A所示[27]。ChSase ABCⅠ的N端是由1–210位的氨基酸構成的雙層β折疊和一個短的α螺旋，該區域的氨基酸序列與裂解碳水化合物酶相似，如木聚糖酶和一些凝集素。中間區域是由211–593位氨基酸構成的15個α螺旋，是主要的催化區域。C端由594–997位氨基酸構成的4個反向平行的β折疊，氨基酸序列與ChSase AC酶的C端有21%的相似性，與肺炎鏈球菌的透明質酸酶有 17 %–19 %的相似性，ChSase ABCⅠ的C端氨基酸的主要作用是裂解CS A、CS C和透明質酸[27-28]。

電子密度圖顯示，ChSase ABCⅠ在中間的α螺旋區域495–530個氨基酸的部位有活性位點，與ChSase AC結構對比后，推測其活性位點為His501、Tyr508和Arg560，并通過定點突變的方法對其進行了驗證[22,29]。結果表明，His501、Tyr508和Arg560都是酶發生催化反應過程中的重要位點，其中Tyr508在裂解CS A、CS C和透明質酸過程中起著重要作用[27,29-30]。筆者所在的實驗室已成功通過定點突變的方法驗證了His501、Tyr508和Arg560為其催化反應的活性位點。2006年Prabhakar等[31]基于鈣離子結合機制推測了ChSase ABCⅠ的裂解機理，通過定點突變和結構模擬分析，發現Asp442、Asp444和Tyr392是與鈣離子距離最近的氨基酸，鈣離子與上述位點結合，朱紅色的四糖底物 (圖2B) 與ChSase ABCⅠ以完全開放的方式結合后，His501、Tyr508和Arg560發揮裂解作用，通過β消除作用將二糖重復單元之間的β-1,3糖苷鍵切斷，降解產物為寡糖，主要是不飽和二糖[32]。

ChSase ABCⅡ的晶體結構與ChSase ABCⅠ非常相似，主要包含3個主要的區域，N端是由14–170位的氨基酸構成的雙層β折疊，且Ca2+結合在第2和第3個β鏈之間。中間區域是由171–593位氨基酸構成的雙層的 (α/α)5折疊，與ChSase AC，透明質酸裂解酶，黃原膠裂解酶和肝素酶Ⅱ相似，有一個與底物結合區域。C端由594–1014位氨基酸構成的4個反向平行的β折疊[27,33]。與ChSase AC結構對比后，推測其活性位點為His454、Tyr461、Arg514和Glu628，同樣通過定點突變實驗驗證了推測結果[33-34]。

3 ChSase ABC的發酵生產

ChSase ABC最早的生產方法是從原始菌中提取獲得，國內最早分離得到的產ChSase ABC的菌株如表3所示，國外的研究重點在ChSase ABC的重組表達方面。

國內對于ChSase ABC的發酵生產研究有很多，但是存在許多問題。一方面發酵生產ChSase ABC的菌株多數為胞內生產方式[22,27,29,31]，且得到的酶活偏低。胞內酶要經過細胞破碎才能得到ChSase ABC，破碎過程中存在細胞破碎不完全、酶活損失、消耗額外能源等弊端。因此發現和篩選出以分泌形式產ChSase ABC的菌株越來越重要，探索不同類型菌株，為后續ChSase ABC的重組表達研究提供重要信息。

另一方面，ChSase ABC發酵生產后的分離純化也存在許多問題[20,26]。分離純化的步驟過于繁瑣，能源消耗大，工業化成本太高，分離純化后得到酶的比活力雖然有一定程度的提高，但總酶活在分離純化的過程中損失了很多。因此，探索新型的分離純化方法，對于ChSase ABC發酵生產顯得尤為重要。另外，發酵條件的優化也是提高酶活的一個重要方面，研究發酵過程中，溫度、pH、碳源、氮源、添加物等對發酵過程的影響，設計正交或響應面實驗來優化發酵條件，從而提高產量和酶活。

4 重組ChSase ABC

對于ChSase的重組表達研究主要集中在ChSase AC和ChSase B，吳敬君等[36]對中的ChSase AC基因進行克隆，得到ChSase AC的基因，通過與麥芽糖結合蛋白 (Maltose-binding protein，MBP) 構建融合表達載體，在大腸桿菌中表達，比酶活達到94.1 U/mg，且經過一步純化后，ChSase AC的純度達到了95%。Pojasek[37-38]對重組ChSase B進行了點突變，并對其應用進行了研究，同樣在大腸桿菌中表達了肝素黃桿菌的基因，并分離純化得到了活性蛋白, 當ChSase AC分別以CS A和CS B為底物檢測時，m分別為0.8 μmol/L和0.6 μmol/L，cat分別為234 s–1和480 s–1，當ChSase B以CS B為底物檢測時，m和cat分別為4.6 μmol/L和190 s–1。Tkalec等[39]在大腸桿菌中表達了ChSase AC和ChSase B，并在培養基中添加CS A作為碳源，且分離純化得到活性蛋白，當ChSase AC以CS A為底物檢測時，酶活為79.5 mU/(mL·600unit)，當ChSase B以CS B為底物檢測時，酶活為29.4 mU/(mL·600unit)。

表3 微生物來源ChSaseABC的基本性質

目前，對于ChSase ABC的重組表達研究很少，Prabhakar等[23,29]將重組到pET-28a載體中，表達后僅一部分蛋白以可溶形式存在，還有大部分以沉淀形式存在。高慧玲等[40]建立了ChSase ABCⅠ分泌型真核表達載體，并在膠質瘤細胞系中對其表達情況進行觀察，結果ChSase ABCⅠ以分泌形式表達。1994年Nobuyuki等[25]對ChSase ABC進行克隆，并在大腸桿菌中表達，最后得到的重組酶與從分離得到的一致。筆者所在的實驗室對重組表達后的ChSase ABCⅠ，通過MBP柱純化，并對其m和cat進行檢測，分別為 (73.1±4.1) μmol/L和(586.7±10.8) s–1，結果與Hamai等[21]直接從分離得到的ChSase ABCⅠ相近。

重組酶對采用親和吸附法進行純化 (如His-tag)，存在許多弊端，成本高，吸附量有限，很難達到工業化生產的標準。

5 ChSase ABC的穩定性研究

ChSase ABC應用于許多功能檢測及功能驗證實驗，特別是在脊柱損傷治療方面，ChSase ABC在進入大鼠體內后能否保持其原有的活性對于其應用前景尤為關鍵，因此ChSase ABC的熱穩定性研究必不可少。2012年Mahdieh等[41]利用共溶劑的方法來提高ChSase ABCⅠ的熱穩定性，選擇了甘油、山梨醇和海藻糖3種化合物來影響ChSase ABCⅠ的熱穩定性。結果表明，3種化合物添加后，ChSase ABCⅠ的催化活性和內熒光強度都有所提高，海藻糖的加入使得ChSase ABCⅠ的熱穩定性得到了顯著的提高，研究結果對臨床用藥方面的指導作用非常明顯。2013年Mahdieh等[42]通過拉式圖分析，Gln140的φ和ψ值均不是最佳，是造成熱穩定性較差的主要因素，隨后通過將Gln140突變成Ala、Gly和Asn來提高熱穩定性。結果表明，分別在4 ℃、25 ℃和40 ℃，Gln140突變成Ala或Gly后，熱穩定性和催化效率與野生型相比顯著提高，而突變成Asn，熱穩定性和催化效率明顯下降。隨著溫度提高，酶的熱穩定性逐漸降低，對于野生型，在4 ℃保存3周后酶活保持80%，在25 ℃保存2周后酶活完全丟失，在40 ℃保存25 min后酶活完全丟失。Gln140突變成Ala后，在4 ℃可以保存3周以上活性未改變，25 ℃時保存3周酶活降低到50 %左右，40 ℃時保存150 min后酶活完全丟失。張德盛等[43]為提高ChSase ABC的熱穩定性，制備ChSase ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球，并觀察其體外釋藥特性，結果發現所制備的ChSase ABC微球形態均勻，粒徑分布窄，再分散性好，釋藥平穩，3周內能維持有效的藥物濃度。

ChSase ABC由于自身是蛋白質的原因，50 ℃時蛋白開始降解，是造成ChSase ABC不穩定的主要原因，限制了ChSase ABC在多方面的應用，尤其是在藥用方面。目前ChSase ABC的穩定性研究還非常有限，還需要探索新型嗜熱來源的酶及研究新型的穩定性制劑來保持酶的活性及穩定性。

6 ChSase ABC的固定化研究

ChSase ABC在很多方面功效顯著，因此對于ChSase ABC的需求量很大。大量生產的ChSase ABC如何重復利用及降低使用成本成了亟待解決的問題。酶的固定化技術是解決這一問題的重要方法，固定化酶是近十余年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫藥等方面有誘人的應用前景。

酶的固定化方法有許多，常用的有吸附法、載體結合法、交聯法、包埋法。ChSase ABC的固定化常用方法為吸附法和交聯法。2004年蔡蘇蘭等[44]從溫和氣單孢菌YH311分離出ChSase ABC，然后利用海藻酸鈉和纖維素固定化，固定化后ChSase ABC 的熱穩定性及貯存穩定性得到大幅度的提高，固定化酶的收率為18.56%和18.86%。2010年牛海濱等[45]利用大孔樹脂D380來固定化ChSase ABC，結果表明在最佳交聯條件下，酶結合效率可達79.1%，固定化后酶m達0.146 g/L，較游離酶高，具有較好的操作穩定性，適于工業化生產。2011年Huang等[46]將ChSase ABC固定在用殼聚糖和明膠做成的孔徑為100–160 μm的神經導管上，且用聚乳酸做成直徑為20–40 μm的微球，固定化之后酶活為0.07 U/mg，48 h后能保持48%的活性，聚乳酸微球在7 d后還能釋放0.0162 U/mL的酶活。2013年Pakulska等[47]通過融合表達的方式，構建了C端有FLAG標簽，N端有His和SH3標簽的融合ChSase ABC (構建思路見圖3)，His 用來純化，同時和FLAG一起參與檢測，SH3用來控制ChSase ABC釋放，實驗結果表明SH3已經成功固定化并控制ChSase ABC釋放。

ChSase ABC的固定化技術還需進一步探索，尋找新型固定化酶的方法，既能保持酶的活性，也能達到重復利用的目的。

圖3 重組蛋白ChSase ABC構建原理圖[47]

7 ChSase ABC 的應用

ChSase ABC為特異性最為廣泛的一類硫酸軟骨素裂解酶，在基礎研究中它用來構建二糖和寡糖的基因文庫[48]；研究糖胺多糖結構和性質[49]；生產低分子量CS；作為CS的檢測劑；在醫藥領域，用來治療一些疾病，如脊柱損傷、軸突再生等[14-15]。

7.1 降解CS

CS作為藥物有很多形式，硫酸軟骨素片、硫酸軟骨素注射液以及硫酸軟骨滴眼液等，它有很多藥效，如促進基質纖維的增長，改善血液循環，消除炎癥，促進角膜愈合，改善眼部干燥等，它還具有抗凝血和防止血管硬化等活性，對冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有較好的療效，對神經細胞、腎細胞等具有保護效應。盡管CS已有很多的藥效，但小分子的CS藥效更為顯著。小分子的CS，以硫酸軟骨素為主體構成的蛋白聚糖在軟骨基質中起著一種“分子彈簧”的作用，具有止痛、促進軟骨再生的功效，可從根本改善關節問題[32]。且低分子量的CS，無論口服或者注射用，吸收效果均優于高分子量CS[50]。低分子量的CS紅外光譜性質、形貌特征等也都被探究，結果表明，低分子量的CS性能優于高分子量的CS[51-52]。

7.2 檢測CS

目前藥典[53]已明確表明，利用硫酸軟骨素ChSase ABC來檢測藥物中CS的含量。鮑倫軍等[54]用ChSase ABC酶解-高效液相色譜的方法檢測魚翅中的透明質酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外檢測波長為226 nm，檢測到魚翅中透明質酸的質量分數為0.86%–1.96%。朱昱寧等[55]同樣用酶解高效液相色譜的方法檢測CS的含量，采用Ultimate XB-NH2柱，紫外檢測波長為232 nm，流動相為醋酸鈉緩沖液 (pH 5.6)-乙腈 (950∶50)，流速為1.0 mL/min，此色譜條件可將CS A、B和C分開。任麗萍等[56]用酶解液相色譜法建立了測定硫酸軟骨素鈉含量的方法，最低檢測限為4.0 μg/mL，定量限為11.9 μg/mL.

7.3 醫藥領域的應用

硫酸軟骨素蛋白多糖 (CSPGs) 是中樞神經系統 (CNS) 損傷后膠質瘢痕的重要成分，具有抑制神經軸突再生的功效。CSPGs主要通過糖氨多糖鏈抑制神經再生，因此去除糖胺多糖或者干擾其合成均可使軸突再生，ChSase能夠降解CSPGs，從而促進軸突再生[57]。除能促進軸突再生外，ChSase還具有緩解視網膜變形、提高后肢運動能力、降解囊性纖維變性部位的黏液物、抗腫瘤作用、增強軟骨組織愈合等功效，具體如表4所示。

表4 ChSaseABC醫療方面應用

8 結語與展望

筆者所在實驗室已成功克隆并在大腸桿菌中表達了來源于(KCTC 2579) 的ChSase ABCⅠ，獲得了目前最高的表達產量，并對重組蛋白進行了純化，檢測了純化后酶的不同酶學性質及不同溫度下的熱穩定性[24]。目前重組菌構建越來越受到關注，ChSase ABC重組菌也越來越多，但是仍然面臨著許多的困難：一方面通過菌體表達得到的重組酶，表達量不高，活性較低，大多數都以包涵體形式表達，再經過后續的包涵體分離純化及復性，得到的酶量有限，活性也有損失。另一方面ChSase ABC的分離純化，常用的是親和吸附法，這種方法的成本很高，是制約酶工業化生產的主要瓶頸。另外，ChSase ABC酶的不穩定性也制約了該酶在諸如醫藥領域領域的應用。

ChSase ABCⅠ的發展受到上述諸多因素的限制，需從以下幾方面入手來改變現狀，首先，需要尋找新型菌株、表達策略及代謝途徑來實現酶的高效分泌表達，避免后續的包涵體復性對酶活性的影響，實現其在工業化中的應用。其次，通過構建含有不同標簽的融合表達載體來實現酶快速和高效分離純化。最后，需研究新方法來增強酶的熱穩定性，延長酶的保藏時間，如尋找耐熱菌來源的ChSase ABCⅠ等。另外，ChSase ABCⅠ的固定化也是研究的一個重要方面，特別是在醫藥領域，如何找到能夠承載ChSase ABCⅠ的合適的藥物載體，來協助其完成特定的藥效功能是亟待解決的問題。

REFERENCES

[1] Bernfield M, Gotte M, Park PW, et al. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annu Rev Biochem, 1999, 68(1): 729–777.

[2] Sugahara K, Mikami T, Uyama T, et al. Recent advances in the structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. Curre Opin Struc Biol, 2003, 13(5): 612–620.

[3] Bao X, Nishimura S, Mikami T, et al. Chondroitin sulfate/dermatan sulfate hybrid chains from embryonic pig brain, which contain a higher proportion of L-iduronic acid than those from adult pig brain, exhibit neuritogenic and growth factor binding activities. J Biol Chem, 2004, 279(11): 9765–9776.

[4] Lamari FN, Karamanos NK. Structure of chondroitin sulfate. Adv Pharmacol, 2006, 53: 33–48.

[5] Ling PX, Chen L, Bian L. Progress on preparation technology of chondroitin sulfate. Food Drug, 2013, 15(1): 59–61 (in Chinese).凌沛學, 陳磊, 邊玲, 等. 硫酸軟骨素制備工藝研究進展. 食品與藥品, 2013, 15(1): 59–61.

[6] Lauder RM. Chondroitin sulphate: a complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems. Compl Ther Med, 2009, 17(1): 56–62.

[7] Yu GL, Zhao X, Zhang TM. Structural character and quality control of chondroitin sulfate. Food Drug, 2010, 12(5): 153–157 (in Chinese).于廣利, 趙峽, 張天民. 硫酸軟骨素的結構特點及其質量控制. 食品與藥品, 2010, 12(5): 153–157.

[8] Xiong SL, Li AL, Wu ZM, et al. Extraction, separation and purification of chondroitin sulfate from chicken keel cartilage. Transa CSAE, 2009, 25(1): 271–275 (in Chinese).熊雙麗, 李安林, 吳照民, 等. 雞胸軟骨硫酸軟骨素的提取及分離純化. 農業工程學報, 2009, 25(1): 271–275.

[9] Aich U, Shriver Z, Tharakaraman K. Competitive inhibition of heparinase by persulfonated glycosaminoglycans: a tool to detect heparin contamination. Anal Chem, 2011, 83(20): 7815–7822.

[10] Garron ML, Cygler M. Structural and mechanistic classification of uronic acid-containing polysaccharide lyases. Glycobiology, 2010, 20(12): 1547–1573

[11] Yamagata T, Saito H, Habuchi O. Purification and properities of bacterial chondroitinase and chondrosulfatase. J Biol Chem, 1968, 243(7): 1523–1535.

[12] Tao K, Wang ZY, Guo JL, et al. The study of chondroitin sulfate lyase ABC bacteria screening and fermentation process. Chin J Antibiotics, 2004, 29(3): 138–141 (in Chinese).陶科, 王忠彥, 國錦琳, 等. 硫酸軟骨素裂解酶ABC產生菌的篩選及發酵工藝研究. 中國抗生素雜志, 2004, 29(3): 138–141.

[13] Makris EA, MacBarb RF, Paschosa NK, et al. Combined use of chondroitinase-ABC, TGF-β1, and collagen crosslinking agent lysyl oxidase to engineer functional neotissues for fibrocartilage repair. Biomaterials, 2014, 35(25): 6787–6796.

[14] Chen XR, Liao SJ, Ye LX, et al. Neuroprotective effect of chondroitinase ABC on primary and secondary brain injury after stroke in hypertensive rats. Brain Res, 2014, 1543: 324–333.

[15] Siebert JR, Stelzner DJ, Osterhout DJ. Chondroitinase treatment following spinal contusion injury increases migration of oligodendrocyte progenitor cells. Exp Neurol, 2011, 231(1): 19–29.

[16] Michel G, Pojasek K, Li Y, et al. The structure of chondroitin B lyase complexed with glycosaminoglycan oligosaccharides unravels a calcium-dependent catalytic machinery. J Biol Chem, 2004, 279(31): 32882–32896.

[17] Huang W, Boju L, Tkalec L, et al. Active site of chondroitin AC lyase revealed by the structure of enzyme-oligosaccharide complexes and mutagenesis. Biochemistry, 2001, 40(8): 2359–2372.

[18] Pojasek K, Raman R, Kiley P, et al. Biochemical characterization of the chondroitinase B active site. J Biol Chem, 2002, 277(34): 31179–31186.

[19] Huang W, Matte A, Li Y, et al. Crystal structure of chondroitinase B fromand its complex with a disaccharide product at 1.7 ? resolution. J Mol Biol, 1999, 294(5): 1257–1269.

[20] Lin XS, Hou LZ, Yang TS. The preparation of chondroitin sulfate lyase ABC. J Norman Bethune Univ, 1997, 23(1): 104–105 (in Chinese).林雪松, 侯立中, 楊同書. 硫酸軟骨素裂解酶ABC的制備. 白求恩醫科大學學報, 1997, 23(1): 104–105.

[21] Hamai A, Hashimoto N, Mochizuki H, et al. Two distinct chondroitin sulfate ABC lyases: an endoeliminase yielding tetrasaccharides and an exoeliminase preferentially acting on oligosaccharides. J Biol Chem, 1997, 272(4): 9123–9130.

[22] Prabhakar V, CapilaⅠ, Bosques CJ, et al. Biochemical characterization of the chondroitinase ABC I active site. Biochem J, 2005, 390(2): 395–405.

[23] Prabhakar V, CapilaⅠ, Bosques CJ, et al. Recombinant expression, purification, and biochemical characterization of chondroitinase ABCⅡ from. J Biol Chem, 2009, 284(2): 974–982.

[24] Chen ZY, Li Y, Yuan QP. Expression, purification and thermostability of MBP-chondroitinase ABC I from. Int J Biol Macromol, 2015, 72: 6–10.

[25] Nobuyuki S, Masahiko S, Hiroshi N, et al. Cloning and expression inof the gene encoding thechondroitin ABC lyase. Appl Microbiol Biot, 1994, 41 (1): 39–46.

[26] Fu JY. Study of the screening, fermentation and purification of chondroitin sulfate enzyme[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012 (in Chinese).付靜蕓. 產硫酸軟骨素酶菌株的篩選、發酵、酶的分離純化及性質的研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2012.

[27] Huang W, Lunin VV, Li Y, et al. Crystal structure ofchondroitin sulfate ABC lyase I at 1.9? resolution. J Mol Biol, 2003, 328(3): 623–634.

[28] Fethiere J, Eggimann B, Cygler M. Crystal structure of chondroitin AC lyase, a representative of a family of glycosaminoglycan degrading enzymes. J Mol Biol, 1999, 288(4): 635–647.

[29] Prabhakar V, Capila I, Bosques CJ, et al. Chondroitinase ABC I from: cloning, recombinant expression and active site identification. Biochem J, 2005, 386(1): 103–112.

[30] Huang WJ, Matte A, Suzuki S, et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of chondroitin sulfate ABC lyasesⅠandⅡ from. Acta Cryst, 2000, 56(7): 904–906.

[31] Prabhakar V, Capila I, Raman R, et al. The catalytic machinery of chondroitinase ABC I utilizes a calcium coordination strategy to optimally process dermatan sulfate. Biochemistry, 2006, 45(37): 11130–11139.

[32] Rye CS, Withers SG. Elucidation of the mechanism of polysaccharide by chondroitin AC lyase from. J Am Chem Soc, 2002, 124(33): 9756–9767.

[33] Shaya D, Hahn BS, Bjerkan TM, et al. Composite active site of chondroitin lyase ABC accepting both epimers of uronic acid. Glycobiology, 2008, 18(3): 270–277.

[34] Shaya D, Hahn BS, Park NY, et al. Characterization of chondroitin sulfate lyase ABC fromWAL2926. Biochemistry, 2008, 47(25): 6650–6661.

[35] Yan HL, He HZ, Cai SL, et al. Screening and purification of chondroitinase from chondroitinase producing strains. Acta Microbiol Sin, 2004, 44(1): 79–82 (in Chinese).閻浩林, 何漢洲, 蔡蘇蘭, 等. 硫酸軟骨素酶產生菌的篩選及酶的分離純化. 微生物學報, 2004, 44(1): 79–82.

[36] Wu JJ, Li Y, Zhang C, et al. Gene cloning and recombinant expression of chondroitinase AC fromand characterization of recombinant fusion enzyme. Food Sci, 2013, 34(9): 127–134 (in Chinese).吳敬君, 李曄, 張翀, 等. 肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC的高效重組表達體系構建及其酶學性質研究. 食品科學, 2013, 34(9): 127–134.

[37] Pojasek K, Raman R, Sasisekharan R. Methods for purifying and isolation recombinant chondroitinases: US, 7129335. 2006-10-31.

[38] Pojasek K, Shriver Z, Kiley P. Recombinant expression, purification, and kinetic characterization of chondroitinase AC and chondroitinase B from. Biochem Bioph Res Co, 2001, 286(2): 343–351.

[39] Tkalec LA, Fink D, Blain F. Isolation and expression inofand, genes coding for the chondroitin sulfate-degrading enzymes chondroitinase AC and chondroitinase B, respectively, from. Appl Environ Microb, 2000, 66(1): 29–35.

[40] Gao HL, Wang Q, Yu SZ, et al. The construction of a secretary eukaryotic expression plasmid of chondroitinase ABC I. Chin J Contemp Neurol Neurosurg, 2010, 10(4): 479–482 (in Chinese).高慧玲, 王虔, 于士柱, 等. 硫酸軟骨素酶ABC Ⅰ分泌型真核表達質粒的構建. 中國現代神經疾病雜志,2010, 10(4): 479–482.

[41] Mahdieh NR, Khosro K, Mahdi A, et al. Co-solvent mediated thermal stabilization of chondroitinase ABC I form. Int J Biol Macromol, 2012, 50(3): 487–492.

[42] Mahdieh NR, Khosro K, Mahdi A, et al. Enhancement of thermal stability of chondroitinase ABCⅠby site-directed mutagenesis: an insight from Ramachandran plot. Biochim Biophys Acta, 2013, 1834(2): 479–486.

[43] Zhang DS, Zhong DJ, Song YM, et al. Preparation andproperties of controlled release poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres incorporating chondroitinase ABC. J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2008, 12(32): 6247–6250 (in Chinese).張德盛, 鐘德君, 宋躍明, 等. 硫酸軟骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物緩釋微球的制備及其體外性質. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008, 12(32): 6247–6250.

[44] Cai SL, Yan HL, He HZ. Purification and immobilization of chondroitinase fromYH 311. Chin J Biotech, 2004, 20(4): 584–588 (in Chinese).蔡蘇蘭, 閻浩林, 何漢洲. 溫和氣單孢菌YH311硫酸軟骨素裂解酶的分離純化與固定化. 生物工程學報, 2004, 20(4): 584–588.

[45] Niu HB, Cai SL, Yan HL, et al. Immobilization of chondroitinase by Macroporous Resin D380. Chin J Biolog, 2010, 23(2): 203–207 (in Chinese).牛海濱, 蔡蘇蘭, 閻浩林, 等. 大孔樹脂D380固定化硫酸軟骨素裂解酶.中國生物制品學雜志, 2010, 23(2): 203–207.

[46] Huang YC, Hsu SH, Chen MT, et al. Controlled release of chondroitinase ABC in chitosan-based scaffolds and PDLLA microspheres. Carbohyd Polym, 2011, 84(2): 788–793.

[47] Pakulska MM, Vulic K, Shoichet MS. Affinity-based release of chondroitinase ABC from a modified methylcellulose hydrogel. J Control Release, 2013, 171(1): 11–16.

[48] Michelacci YM, Horton DSPQ, Poblacion CA. Isolation and characterization of an induced chondroitinase ABC from. Biochim Biophy Acta, 1987, 923(2): 291–301.

[49] Li YR. The Biochemistry and Research Methods of Extracellular Matrix. Beijing: People’s Medical Publishing House, 1988: 170–200 (in Chinese).李玉瑞. 細胞外間質的生物化學及研究方法. 北京: 人民衛生出版社, 1988: 170–200.

[50] Xiong SL, Jin ZY. Preparation of chondroitin sulfate with different molecular weight and antioxitation capacity. Chin Tradit Patent Med, 2006, 28(9): 1343–1346 (in Chinese).熊雙麗, 金征宇. 不同分子量硫酸軟骨素的制備和抗氧化活性探討. 中成藥,2006, 28(9): 1343–1346.

[51] Shi MJ, Xiong SL, Wang YY, et al. Preparation and properties of low molecular weight chondroitin sulfate. Fine Chem, 2012, 29(11): 1088–1093 (in Chinese).史敏娟, 熊雙麗, 王瑩瑩, 等. 低相對分子質量硫酸軟骨素的制備及其性質. 精細化工, 2012, 29(11): 1088–1093.

[52] Xiao YL, Li PL, Cheng YN, et al. Enhancing the intestinal absorption of low molecular weight chondroitin sulfate by conjugation with α-linolenic acid and the transport mechanism of the conjugates. Int J Pharm, 2014, 465(1): 143–158.

[53] National Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of People’s Republic of China. Part 2. Beijing: Chemical Industry Press, 2010: 984–986.國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 2部. 北京: 化學工業出版社, 2010: 984–986.

[54] Bao LJ, Yang JC, He ZH, et al. Zymohydrolysis with chondroitinase ABC and high performance liquid chromatography used for the determination of hyaluronic acid in shark fin. Chin J Chromatogr, 2002, 20(6): 557–559 (in Chinese).鮑倫軍, 楊建成, 何振華, 等. 軟骨素酶ABC酶解–高效液相色譜法測定魚翅中的透明質酸. 色譜, 2002, 20(6): 557–559.

[55] Zhu YN, Ao L, Fu YH. Determination of chondroitin sulfate content by enzymatic HPLC. Chin J Biological Pharms, 2012, 33(6): 827–829 (in Chinese).朱昱寧, 敖雷, 傅應華. 酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量. 中國生化藥物雜志, 2012, 33(6): 827–829.

[56] Ren LP, Yu HZ, Song YR, et al. Enzymolysis-HPLC determination of the content of chondroitin sulfate sodium. Chin J Pharm Analysis, 2012, 32(7): 1246–1248 (in Chinese).任麗萍, 于海洲, 宋玉娟, 等. 酶解液相色譜法測定硫酸軟骨素鈉含量. 藥物分析雜志, 2012, 32(7): 1246–1248.

[57] Shields LB, Zhang YP, Burke DA, et al. Benefit of chondroitinase ABC on sensory axon regeneration in a laceration model of spinal cord injury in the rat. Surq Neurol, 2008, 69(6): 568–577.

[58] Huang YM, Gao PF, Xu YN, et al. Chondroitinase ABC alleviates photoreceptor apoptosis in the retinae . J Yangzhou Univ, 2012, 33(4): 19–23 (in Chinese).黃玉苗, 高朋芬, 胥亞男, 等. 硫酸軟骨素酶緩解視網膜變性大鼠光感受器細胞凋亡. 揚州大學學報, 2012, 33(4): 19–23.

[59] Sun YX, Liu N, Xu AH, et al. The effect of chondroitinase ABC combined with hyperbaric oxygen preconditioning treatment on the motor function of hindlimbs in spinal cord injury rats. Proc Anat Sci, 2012, 18(6): 526–529 (in Chinese).孫永新, 劉寧, 徐愛華, 等. 硫酸軟骨素酶ABC聯合高壓氧預處理對脊髓損傷大鼠后肢運動功能的影響. 解剖科學進展, 2012, 18(6): 526–529.

[60] Tester NJ, Howland DR. Chondroitinase ABC improves basic and skilled locomotion in spinal cord injured cats. Exp Neurol, 2008, 209(2): 483–496.

[61] Jiang LF, Chen O, Chu TG. Decellularized nerve allograft treated with chondroitinase ABC for repair of peripheral nerve defects: an experimental study. Chin J Hand Surg, 2013, 29(4): 208–211 (in Chinese).蔣良福, 陳鷗, 褚庭綱. 硫酸軟骨素酶處理的異體去細胞神經修復周圍神經缺損的實驗研究. 中華手外科雜志, 2013, 29(4): 208–211.

[62] Bhaskar KR, Lamont JT. Use of chondroitinase in the manufacture of a medicament in the treatment and prevention of muciod secretions: US, 1998046258. 1999-03-11.

[63] Brown, MD. Method for treating intervertebral disc displacement with enzymes: US, 4696816. 1987-09-29.

[64] Henderson N, Stanescu V, Cauchoix J. Nucleolysis of the rabbit intervertebral disc using chondroitinase ABC. Spine, 1991, 16(2): 203–208.

[65] Kato F, Lwata H, Mimatsu K, et al. Experimental chemonucleolysis with chondroitinase ABC. Clin Orthop, 1990, 253(2): 301–308.

[66] Denholm EM, Lin YQ, Silver PJ. Anti-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinase B: inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion. Eur J Pharmacol, 2001, 416(3): 213–221.

[67] Lee MC, Sung KL, Kurtis MS, et al. Adhesive force of chondrocytes to cartilage effects of chondroitinase ABC. Clin Orthop, 2000, 370(1): 286–294.

[68] Yao J. Controlled release tissue engineering scaffolds delivering chondroitinase ABC repair in the injury of spinal hemisection[D]. Ji’nan: Shandong University, 2013 (in Chinese).姚軍. 硫酸軟骨素酶ABC緩釋組織工程支架對大鼠脊髓半切損傷修復研究[D]. 濟南: 山東大學, 2013.

(本文責編陳宏宇)

Research progress in chondroitinase ABC

Ye Li1*, Zhenya Chen2*, and Qipeng Yuan2

1,,100029,2,,100029,

As thecomponents of proteoglycans, glycosaminoglycans (GAGs) are linear polysaccharides consisting of hexose and uronic acid units linked by β-1,3-glycosidic bond. GAGs mainly distribute in extracellular matrix and on cell surfaces. They guide many biological processes, such as proliferation of cells, transmission of signals and mediation of inflammation. Because of their large molecular weights, GAGs have limited biological functions. However, the appearance of chondroitinase ABC (ChSase ABC), which can lyse polysaccharides, solves the difficulties. Based on our work, we summarized the classification and the crystal structure of ChSase ABC, as well as other recent research progress on ChSase ABCs. The separation and purification methods of ChSase ABC and construction of engineering bacteria are illustrated. The stability and immobilization are also analyzed by taking account of the characterization of ChSase ABC. Finally, problems and future prospect of the ChSase ABC study are summarized.

ChSase ABC, characterization, production, application

September 22, 2014; Accepted:November 15, 2014

Qipeng Yuan. Tel/Fax: +86-10-64437610; E-mail: yuanqp@mail.buct.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21306002), The Science-Technology Foundation of Beijing Municipal Commission of Education (No. KM201410858002), The Youth Elite Project of Higher Education of Beijing (No. YETP1801), The Construction of Scientific Research Base-Science and Technology Innovation Platform Project-the Construction of Enzyme Preparation Research Base Projects (No. PXM2014_014306_000064).

國家自然科學基金 (No. 21306002)，北京市教委2014年度科技計劃面上項目 (No. KM201410858002)，北京高等學?！扒嗄暧⒉庞媱潯?(No. YETP1801)，科研基地建設-科技創新平臺項目-酶制劑研發基地建設項目(No. PXM2014_014306_000064) 資助。

網絡出版時間：2014-12-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/j.cjb.140459.html

*These authors contributed equally to this study.