菊粉酶基因的異源表達、分離純化及酶學性質

李益民，高教琪，袁文杰，相瑞娟，侯勝博

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菊粉酶基因的異源表達、分離純化及酶學性質

李益民，高教琪，袁文杰，相瑞娟，侯勝博

大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116024

李益民, 高教琪, 袁文杰, 等. 菊粉酶基因的異源表達、分離純化及酶學性質. 生物工程學報, 2015, 31(5): 670–681.Li YM, Gao JQ, Yuan WJ, et al. Heterologous expression,purification and characterization of exo-inulinase from Kluyveromyces marxianusYX01. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 670–681.

為進一步提高菊粉酶在生物技術領域的應用，研究了來源于馬克斯克魯維酵母YX01的菊粉酶性質。通過在畢赤酵母GS115宿主細胞中異源表達該菊粉酶基因 ()，獲得了一種外切型菊粉酶，經聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 驗證其分子量為86.0 kDa。進一步在該菊粉酶上增加6個His標簽，采用聚乙二醇 (PEG) 20 000透析濃縮和Ni-NTA Agarose靜態親和吸附作用的方法，完成菊粉酶的分離純化，純化倍數和酶回收率分別為3.6和33.1%。比較發現粗酶液與純酶的酶學性質相似，且菊粉酶的最適反應溫度為60 ℃，最適pH值為4.62，并測得該酶的m和max值，以菊粉為底物時，m和max值分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)；以蔗糖底物時，m和max值分別為183.10 g/L和20.20 g/(L·min)。金屬離子Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+對酶活力具有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+和Fe2+的抑制作用最為顯著。這些研究為進一步提高菊粉酶在工業化的應用奠定了基礎。

馬克斯克魯維，菊粉酶，重組表達，分離純化，酶學性質

菊粉存在于許多植物的根和塊莖中 (如菊芋、大麗花和菊苣)，是一種具有代表性的非糧食作物[1]。菊粉酶(Inulinase) 是一類能夠水解菊粉β-2,1-D-果聚糖果糖糖苷鍵的水解酶[2-4]，根據對菊粉的作用方式，可分為內切型菊粉酶(Endoinulinase，EC 3.2.1.7) 和外切型菊粉酶(Exoinulinase，EC 3.2.1.80)[1,5-6]。內切型菊粉酶隨機水解菊粉內部的β-2,1-果聚糖果糖糖苷鍵，形成低聚三糖、四糖和五糖，主要水解產物是低聚果糖；外切型菊粉酶與菊粉分子鏈非還原性末端的糖苷鍵發生作用，逐個分離果糖單元，主要水解產物是果糖[7-8]。內切型菊粉酶和外切型菊粉酶的區分常用值的大小來作為酶學性質的指標，其中是以菊粉為底物時的酶活，是以蔗糖為底物時的酶活。一般以=1作為區分界限，外切型菊粉酶的值低(小于1)，內切型菊粉酶的值高(大于1)[9-10]。

天然菊粉酶的產生菌株主要包括絲狀真菌、酵母和細菌，如克魯維酵母屬、曲霉屬、葡萄球菌屬、黃單胞菌屬和假單胞菌屬。在這些微生物中，由于絲狀真菌和酵母屬的菊粉酶生產水平優于細菌，因此報道和研究較多的有乳酸克魯維酵母[11-12]、，乳酒假絲酵母、德巴利酵母菌、青霉菌屬sp.和曲霉菌屬sp.等[13-14]；異源表達菊粉酶的過程中，目的基因可來自于絲狀真菌 (例如：黑曲霉inu-8)[15]、酵母 (例如：)[16]和細菌 (例如：多粘芽胞桿菌ZJ-9)[1]，從細菌克隆的菊粉酶基因也能像絲狀真菌和酵母來源的一樣，很好地在其他工業菌種中表達。此外，畢赤酵母是菊粉酶異源表達中最常見的宿主菌株之一，目前研究較多的表達宿主GS115、PMAD11、PMAD16、KM17、X-33、SMD1168等，均為野生型石油酵母Y11430突變產生，絕大多數是以甲醇作為唯一碳源的甲醇營養缺陷型酵母[17]。最后，將異源菊粉酶基因通過不同的表達載體，如常用的酵母表達載體：整合型載體 (YIp) 和附加型載體 (YEp)，轉入到宿主菌株中，實現菊粉酶的異源表達。

國內外菊粉酶的研究方向主要包括產酶菌株的篩選、產酶條件的優化、誘導育種、菊粉酶的分離純化以及利用微生物源菊粉酶生產超高果糖漿和生物乙醇發酵。目前，對菊粉酶及產生菌株的固定化技術和菊粉的水解工藝方向的研究也日益深入[18]。菊粉酶以菊粉作為原料生產高果糖漿、低聚果糖、乙醇以及其他新型經濟產品，在食品、醫藥、保健等領域具有廣泛的應用價值和巨大的經濟價值[19-20]。然而，正常發酵條件下菊粉酶分泌表達不足或酶穩定性較差阻礙了其工業化生產的進程。

在前期的研究中，本實驗室篩選得到一株馬克斯克魯維酵母YX01，它是能發酵菊芋生產乙醇且具有耐熱特性的優良菌株，可能存在性質不同的菊粉酶。因此，本文對該菊粉酶基因的克隆、異源表達、酶的分離純化和酶學性質進行研究，為進一步提高其在生物技術中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

馬克斯克魯維酵母YX01 (ATCC8554，本實驗室馴化保存)；大腸桿菌DH5α (本實驗室保存)；畢赤酵母GS115 (本院楊青教授實驗組贈予)。

YPD培養基(g/L)：酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0；若需要固體培養基則再加入2.0% (/) 的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

LB培養基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0；若需要固體培養基則再加入2.0% (/) 的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

RDB轉化培養基：超純水80 mL，山梨醇18.6 g (186 g/L)，瓊脂粉2.0 g (20 g/L)；121 ℃滅菌20 min，待溫度降至60 ℃后，在超凈工作臺內加入10×YNB 10.0 mL、10×D (20%葡萄糖) 10.0 mL、100×B (0.004%生物素) 1.0 mL、100×AA (0.5%各種氨基酸) 1.0 mL，混勻倒平板。

BMGY誘導表達培養基(g/L)：酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，K2HPO43.0，KH2PO411.8，超純水885 mL；121 ℃滅菌20 min，待溫度降至60 ℃后，在超凈工作臺內加入10×YNB 100.0 mL、100×B 5.0 mL、甘油10.0 mL。

BMMY誘導表達培養基(g/L)：酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，K2HPO43.0，KH2PO411.8，超純水890 mL；121 ℃滅菌20 min，待溫度降至60 ℃后，在超凈工作臺內加入10×YNB 100.0 mL、100×B 5.0 mL、甲醇5.0 mL。

PCR產物純化試劑盒(Cycle-pure kit)、膠回收純化試劑盒(Gel extraction kit) 和質粒提取試劑盒(Plasmid mini kit I)，均購自Omega公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自北京Solarbio公司；比利時進口菊粉聚合度為10–20；此外，Ⅱ、Ⅰ、Ⅰ、DNA聚合酶、10×PCR 緩沖液、dNTP Mixture、T4DNA連接酶、10×T4 DNA緩沖液、10×H緩沖液、0.1% BSA緩沖液、1 kb DNA ladder (Dye plus)、 DL2 000 DNA marker等分子試劑均購自 TaKaRa 公司；Ni-NTA Agarose，購自QIAGEN公司；其他試劑為國產分析純以上。

1.1.2 儀器與設備

低溫振蕩培養箱(ZQZY-70B，上海知楚儀器)；酶標儀(Thermo)；臺式高速冷凍離心機(Sigma公司)；紫外投射反射儀(上海精科實業有限公司)；PCR Thermal Cycler Dice (TaKaRa公司) 等。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與DNA擴增

以YX01酵母基因組DNA作為模板，以IF (5′-CCGATGAAGTTCGCA TACTCC-3′) 和IR(5′-ATAAGAATTC AATGATGATGATGATGATGAACGTTAAATTGGGT-3′) 為引物進行PCR擴增，純化回收PCR產物。其中引物IF和IR中，小寫斜體為引物的Ⅰ和Ⅰ酶切位點，IR上粗體標記了6×His標簽用于后續的分離純化。

1.2.2 構建重組載體與陽性轉化子的篩選

將純化后PCR產物與載體質粒pPIC9均用Ⅰ和Ⅰ進行雙酶切處理，切膠純化后使用T4 DNA連接酶16 ℃下過夜連接。熱擊法將重組質粒 pPIC9-inu轉化至大腸桿菌DH5α細胞中，測序驗證。提取測序正確的重組質粒，根據質粒上限制酶Ⅱ的兩個酶切位點，獲得線性重組質粒pPIC9-inu，并通過電擊轉化法轉入畢赤酵母GS115感受態細胞中，溫育5 h后涂布于RDB平板，30 ℃倒置培養2 d。

同時，由于畢赤酵母GS115為組氨酸缺陷型，而載體上帶有4基因，兩者均不能單獨在RDB轉化平板(無His) 上生長，只有整合的轉化子才可以生長的原理，進行轉化子的第一次篩選。且由于外源基因的整合，陽性轉化子利用甲醇的能力降低，利用陽性轉化子在以甲醇為唯一碳源的培養基上生長緩慢或不能正常生長的原理，從RDB轉化平板上挑取單菌落分別用無菌牙簽接種到MD和MM選擇培養基上，篩選能在MD選擇培養基上正常生長，但是在MM選擇培養基上不能生長或生長緩慢的陽性轉化子，并進行PCR驗證。

1.2.3 菊粉酶的異源表達與分離純化

將PCR鑒定正確的陽性轉化子接種到 50 mL的BMGY增殖培養基中(250 mL三角瓶盛裝)，30 ℃、150 r/min培養2 d后，離心收集細胞，按照20%的接種量接種到100 mL的BMMY誘導培養基中，30 ℃、150 r/min誘導培養，每間隔12 h取樣，測發酵液的生物量、蛋白濃度，以及采用DNS法在540吸光值條件下測菊粉酶酶活，并毎間隔24 h補加1%的甲醇(已過膜除菌)。發酵192 h后終止發酵，使用低溫冷凍離心機4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集發酵上淸液。

將適當的上清液加入透析袋內，利用聚乙二醇(PEG 20 000) 的吸水作用，濃縮液體。然后，采用Ni-NTA Agarose靜態親和吸附法分離純化菊粉酶：利用菊粉酶的His標簽與Ni-NTA Agarose之間的親和作用，使其吸附在Ni-NTA Agarose上，緩沖液洗脫雜蛋白后，再用高咪唑濃度的洗脫液少量多次洗脫得到菊粉酶的單一純酶溶液。

1.2.4 SDS-PAGE與菊粉酶活性的測定

采用SDS-PAGE測定菊粉酶分子質量，使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件：80 V，50 min，分離膠電泳條件：120 V，60 min?？捡R斯亮藍染色3 h，用脫色液過夜脫色。

研究該菊粉酶的酶切作用方式：取50 μL洗脫液(純菊粉酶)，加入450 μL 5%菊粉溶液 (0.1 mol/L HAc-NaAc，pH 4.6緩沖液) 60 ℃水浴反應10 min后，立即沸水浴5 min滅活，采用DNS法測定還原糖的含量(mg)；取50 μL洗脫液(純菊粉酶) 沸水浴5 min滅活，同上條件反應作對照組。用表示，以菊粉為底物時，每分鐘產生1 μmol還原糖所需要的酶量。用5%蔗糖溶液代替5%菊粉溶液，在相同條件下，同上反應。用表示，以蔗糖為底物時，每分鐘產生1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.2.5 菊粉酶的最適溫度及熱穩定性

實驗組：向50 μL 酶液中加入450 μL 5%菊粉溶液(0.1 mol/L HAc-NaAc，pH 4.6緩沖液) 分別置于不同溫度(30–80 ℃) 的水浴鍋中反應10 min后，立即沸水浴5 min滅活，測定不同溫度下的酶活；對照組：取50 μL 酶液沸水浴5 min滅活，反應條件同上。此外，將酶液分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋中保溫30 min后，立即冰浴冷卻，60 ℃反應10 min測定不同溫度下的殘留酶活，以4 ℃保存的酶活力為100%，求出其他溫度的相對殘留酶活。

1.2.6 菊粉酶的最適pH及酸堿穩定性

實驗組：分別用pH 2.81、3.68、3.92、4.72、5.72 (0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液) 和6.12、7.15、8.20 (0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液) 配制5% (/) 菊粉溶液，60 ℃反應10 min測定不同pH值條件下的酶活；對照組：取50 μL 酶液沸水浴5 min滅活，反應條件同上。將酶分別在上述pH值的緩沖液中30 ℃放置30 min后，測定其殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力作為100%。

1.2.7 金屬離子對酶活力的影響

向酶反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度達到10 mmol/L，并以未加金屬離子(用相同體積的雙蒸水代替) 處理酶的酶活力為100%，求出加入不同金屬離子后的相對殘留 酶活。

1.2.8 菊粉酶對菊粉和蔗糖底物的催化動力學

本實驗采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定m和max值，根據米氏方程的雙倒數表達式(1)：

以1/[]為橫坐標，以1/為縱坐標作圖，得到一條直線。根據直線的縱截距可求出max值，再由斜率計算得到m值。以菊粉和蔗糖分別作為底物，在不同的底物濃度(2%、3%、4%、5%、6%、7%、10% 0.1 mol/L HAc-NaAc) 以及最適反應溫度和最適pH值的條件下反應 10 min，測定反應產物中還原糖的增加量，并規定酶反應的初始速率為產物在單位時間內還原糖的增加量[21]。

2 結果與分析

2.1 菊粉酶基因表達載體的構建

首先以YX01酵母的基因組為模板，IF/IR為引物擴增出菊粉酶基因()，大小約為1.7 kb，與NCBI所公布的菊粉酶基因(GenBank Accession No. EU719651) 大小一致；然后，將Ⅰ和Ⅰ雙酶切純化后的目的基因() 與質粒pPIC9連接，并熱擊轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取重組質粒，進行菌液PCR、雙酶切驗證和測序，結果如圖1所示，證明表達載體構建成功。

2.2 表達載體的轉化與轉化子驗證

將切膠回收的限制酶Ⅱ單酶切重組質粒pPIC9-線性片段，電轉至畢赤酵母GS115感受態細胞中，溫育5 h后涂布于RDB轉化平板，30 ℃倒置培養2 d。結果發現實驗組的RDB轉化平板上有若干單菌落生長，陰性對照組(只有GS115感受態細胞) 的RDB轉化平板上無單菌落生長，證明重組質粒的線性片段已整合到酵母基因組上。

從RDB轉化平板上挑取單菌落分別用無菌牙簽接種到MD和MM選擇培養基上，并挑取在MD選擇培養基上正常生長，而在MM選擇培養基上不生長或生長緩慢的轉化子，接種到YPD液體培養基中，30 ℃、150 r/min培養20 h后，提取其基因組并進行PCR驗證，結果如圖2所示，陰性對照(PCR驗證反應體系中不加基因組模板而加ddH2O) 無目的條帶；實驗組4–10號未驗證出結果，說明篩選獲得的轉化子中存在一定的假陽性；陽性對照(PCR驗證反應體系中以YX01基因組為模板) 和實驗組3、11、12號PCR驗證出目的條帶，完成了陽性轉化子的篩選和鑒定。

2.3 菊粉酶的誘導表達及分子量

將PCR驗證正確的陽性轉化子，在用BMGY培養基30 ℃增殖培養2 d后，離心收集菌體換BMMY誘導培養基培養(平行實驗)，每間隔12 h取樣一次，每間隔24 h補加1%的甲醇，誘導培養8 d后，終止發酵收集上清液。用0.1 mol/L的檸檬酸鈉10倍稀釋發酵液，620測量生物量，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒稀釋后測發酵結束后的蛋白濃度，采用DNS法測發酵液酶活，每單位菊粉酶酶活力定義為：以菊粉為底物，在pH 4.6 (0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液)、60 ℃的反應條件下，每分鐘內產生 1 μmol果糖所需要的酶量，即定義為一個酶活力單位(U)。粗酶發酵上清液液生物量和酶活力隨時間的變化曲線，結果如圖3所示，菌體的生物量在156 h后620達到峰值為4.84；菊粉酶酶活力在用1%甲醇連續誘導180 h后達到峰值為54.91 U/mL，計算求得粗酶液中菊粉酶的最高比活力為2 614.76 U/mg。根據組成菊粉酶的各種氨基酸分子量計算，菊粉酶的理論分子量為65.0 kDa。而SDS-PAGE結果顯示純菊粉酶的分子量大小約為86.0 kDa，結果如圖4所示。分析認為，菊粉酶分子量的增加很可能是由于其序列中存在一些糖基化位點，因而在畢赤酵母表達系統中出現大量的糖基化修飾(包括N-糖基化和O-糖基化) 導致電泳圖中目的條帶較寬，菊粉酶分子量增加，使得在SDS-PAGE中遷移速率改變。

圖1 重組質粒的雙酶切驗證及抗性菌株的PCR驗證

圖2 重組酵母的PCR驗證

圖3 生物量與酶活力隨時間的變化曲線

2.4 菊粉酶的分離純化及酶切性質

本實驗中分離純化粗酶液中菊粉酶的步驟簡便快捷，采用兩步法即可獲得高比活力的菊粉酶。首先，通過聚乙二醇 (PEG 20 000) 透析濃縮粗酶液，將250 mL的粗酶液濃縮至40 mL，濃縮倍數為6.25，由于透析袋的孔徑大小為 8 000，分子量小于8 000的雜蛋白可以透過，所以也能夠起到去除雜蛋白的作用。然后，通過Ni-NTA Agarose靜態親和吸附的方式吸附菊粉酶蛋白[22]，去除了所有的殘余雜蛋白，洗脫后完成了對菊粉酶的純化。在濃縮過程中，幾乎沒有目標蛋白的損失，濃縮前總酶活為 13 750.0 U，濃縮后總酶活為13 200.0 U，酶回收率為96.0%；純化前菊粉酶的比活力為 2 632.1 U/mg，而純化后菊粉酶的比活力為 9 448.1 U/mg，純化倍數為3.6；取5 mL濃縮液加入5 mL緩沖液稀釋后的總酶活為1 650.0 U，吸附純化后測得總酶活為546.0 U，因此最終酶回收率為33.1%。

研究菊粉酶的作用方式通常是以值作為區分依據，本實驗分別以菊粉和蔗糖為底物，測得菊粉酶的值為0.436 (<1)，因此屬于外切型菊粉酶。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.5 溫度對菊粉酶活性的影響

本實驗設立不同的溫度梯度 (30–80 ℃)，與5%菊粉溶液 (0.1 mol/L HAc-NaAc，pH 4.6緩沖液) 反應10 min。結果如圖5所示，菊粉酶純酶的最佳反應溫度是60 ℃。將酶液分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋內保溫30 min，再與5%菊粉溶液 (0.1 mol/L HAc-NaAc，pH 4.6緩沖液) 60 ℃反應10 min，測定溫度對酶熱穩定性的影響，結果如圖5所示，菊粉酶純酶在30–50 ℃之間熱穩定性較好，30 ℃、40 ℃下保溫30 min，分別能保留99.9%和87.7%的酶活力，在40 ℃下保溫 100 min，仍能保留46.4%的酶活力；但是，一旦溫度超過50 ℃，該菊粉酶的熱穩定性迅速下降直至基本喪失活性，60 ℃下保溫30 min后，殘余酶活力不足10.0%。此外，將少量酶置于4 ℃保存25 d后，酶活不損失，因此該酶可以在較低溫度下長時間保存。

圖5 溫度對酶活性與酶穩定性的影響

2.6 pH對菊粉酶活性的影響

在最適反應溫度為60 ℃的反應條件下，將酶液與菊粉分別在不同pH值 (2.81、3.68、3.92、4.62、5.72、6.12、7.15、8.20) 的0.2 mol/L緩沖液中反應10 min，測定該菊粉酶的最適pH值，結果如圖6所示，最適pH值為4.62。當pH高于或低于4.62時，菊粉酶的活性迅速降低。同時，研究發現pH對酶穩定性的影響較小，在pH 4.60–5.20范圍內，酶穩定性更佳。

2.7 金屬離子對菊粉酶活性的影響

金屬離子對該菊粉酶酶活力的影響如圖7所示。從圖中可知，K+和Mg2+對酶活力沒有明顯的影響；而金屬離子Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+對菊粉酶酶活力具有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+和Fe2+的抑制作用最為 顯著。

2.8 菊粉酶的m和max值

本實驗分別以菊粉和蔗糖作為底物，在最適溫度為60 ℃、最適pH值為4.62的反應條件下，與不同濃度的底物(2%、3%、4%、5%、6%、7%、10% 0.1 mol/L HAc-NaAc) 反應 10 min，測出了產物中還原糖的增加量，結果如圖8所示，并根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定m和max值，其中m值分別為80.53 g/L和183.10 g/L，max值分別為4.49 g/(L·min) 和20.20 g/(L·min)。

圖6 pH對酶活性的影響

圖7 金屬離子對酶活力的影響

圖8 菊粉酶的1/v和1/[S]關系圖(A：菊粉作為底物；B：蔗糖作為底物)

3 討論

通過分子生物學手段擴增了YX01菊粉酶基因()，并構建了重組基因表達載體，實現了菊粉酶基因的異源表達。本研究所得菊粉酶的氨基酸序列，用Clustal X軟件與其他文獻報道序列比對分析，發現該菊粉酶具有與它們相一致的菊粉酶保守序列(WMNXPNGL) 和(RDPKVF)[24]。本實驗為了后續分離純化實驗，導入了6個His標簽，發酵過程中檢測到酶活力，說明His標簽并不影響酶的活性；在誘導表達過程中，菊粉酶分泌表達量達到最高時的誘導時間天數為7 d，之后由于培養基內營養物質的缺乏，有毒物質的逐漸積累，菌體逐漸死亡，酶活力在從8 d開始降低。和其他菊粉酶異源表達研究文獻相比較，本實驗中菌體生物量和酶活力達到峰值所需的誘導時間較長，分析認為，可能與發酵過程中培養基配方、搖床轉數、搖瓶大小和發酵液體積等因素有關，后續應優化培養條件，實現菊粉酶的快速分泌表達。

在酶的分離純化過程中，通過兩步法便捷的獲得了菊粉酶的純酶液，純化倍數為3.6，最終酶回收率為33.1%。經SDS-PAGE驗證，菊粉酶分子量增加，分析認為可能是由于多糖基化修飾作用的影響。對菊粉酶的酶學性質的結果表明該酶為外切型菊粉酶，最適溫度為60 ℃，最適pH值為4.62，并測得該酶的m和max值，以菊粉為底物時，m和max值分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)；以蔗糖底物時，m和max值分別為183.10 g/L和20.20 g/(L·min)?？琢顖缘萚25]和熊伍平等[26]報道，金屬離子Mn2+、Mg2+、Ca2+以及K+對菊粉酶的酶活力具有顯著的促進作用，但本實驗中這些金屬離子對菊粉酶未發現明顯的促進作用；而金屬離子Cu2+、Zn2+和Fe2+對該菊粉酶酶活力具有顯著的抑制作用，與報道結果相一致。同時，與已報道的馬克斯克魯維酵母DSM 5418菊粉酶 (編碼基因GenBank Accession No. JQ411233) 相比，兩者基因同源性達到99%，來源于YX01菊粉酶基因僅在第73、211和400位的氨基酸發生突變，但菊粉酶最適反應溫度較高，最適pH值低，因而推測這3個突變的氨基酸影響了菊粉酶的酶學性質，使得該菊粉酶在高溫、低pH的生產條件下具有更加良好的應用性。但研究發現，該酶的熱穩定性較差，超過50 ℃以后酶活性迅速下降，這可能是導致其酶活力偏低，制約其工業化生產的關鍵因素。

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(本文責編 郝麗芳)

Heterologous expression,purification and characterization of exo-inulinase fromYX01

Yimin Li, Jiaoqi Gao, Wenjie Yuan, Ruijuan Xiang, and Shengbo Hou

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To improve the inulinase application in biotechnology, the characteristic of inulinase fromYX01 was investigated. Thegene ofYX01 was transformed intoGS115 host cells with molecular biology techniques. Then we achieved the heterologous expression of exo-inulinase whose molecular mass was about 86.0 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). Furthermore, six His-tag was added to the inulinase and a two-step method was applied in the purification of inulinase, including concentration via dialysis by polyethylene glycol 20 000 and metal Ni-NTA Agarose affinity adsorption. The purification factor of purified protein was 3.6 and the recovery rate of enzyme activity was 33.1%. We characterized the purified inulinase. The optimum temperature was 60 ℃ and pH was 4.62. When inulin and sucrose were used as substrates, themandmaxvalues were 80.53 g/L vs 4.49 g/(L·min)and 183.10 g/L vs 20.20 g/(L·min), respectively. In addition, metal ions including Mn2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+and Fe2+exhibited different degrees of inhibition on the enzyme activity, and Cu2+, Zn2+and Fe2+exhibited the most significant inhibition. Our findings might lay a good foundation for industrial application of inulinase.

, inulinase, heterologous expression, purification, enzymatic properties

September 28, 2014; Accepted:November 26, 2014

Wenjie Yuan. Tel/Fax: +86-411-84706308; E-mail: ywj@dlut.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21106016), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. DUT14LK33).

國家自然科學基金 (No. 21106016)，中央高?；緲I務費 (No. DUT14LK33) 資助。

網絡出版時間：2015-01-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150115.0927.003.html