MDRV P10基因的克隆、分析及蛋白質結構預測

蔡一龍 ,莊育彬 ,周五朵 ,王全溪 ,邱曉東 ,吳寶成

(福建農林大學動物科學學院 ,福州350002)

MDRV P10基因的克隆、分析及蛋白質結構預測

蔡一龍 ,莊育彬 ,周五朵 ,王全溪 ,邱曉東 ,吳寶成

(福建農林大學動物科學學院 ,福州350002)

參考GenBank中番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus ,MDRV)S4基因序列 ,設計合成一對非結構蛋白P10基因的特異性引物 ,以MDRV-YB株病毒RNA為模板進行RT-PCR擴增 ,并將目的基因克隆到PGEM-T載體 ,提取質粒測序.對測序結果進行遺傳進化樹分析和生物信息學軟件預測、分析蛋白質結構和功能.結果表明 ,MDRV-YB株病毒的P10蛋白基因開放閱讀框(ORF)全長為288 bp ,編碼95個氨基酸.核苷酸比對結果表明 ,與標準株法國MDRV-89026株同源性為95% ,而與ARV-S1133株氨基酸同源性僅為21.9%.運用ProtParam tool軟件對番鴨呼腸孤病毒的P10蛋白分析結果表明 ,該蛋白分子質量為10.7 ku ,不穩定系數為52.37 ,不存在信號肽和糖基化位點 ,有4個絲氨酸和1個絡氨酸的磷酸化位點.此外 ,MDRV的P10蛋白為疏水性蛋白 ,但不存在跨膜區 ,這與禽呼腸孤病毒(Avian reo virus ,ARV)的P10蛋白具有較大差異.二級結構分析表明 ,MDRV-YB株的P10蛋白與ARV-S1133株P10蛋白相比 ,α-螺旋和無規則卷曲減少 ,β-折疊則增加.因此 ,MDRV-YB株的非結構蛋白P10不僅在基因水平上發生了較大的變異 ,而且在蛋白質性質與結構上也發生了較大的變異 ,其與該病毒毒力的增強可能存在一定的關系.

番鴨呼腸孤病毒；P10；基因克??；蛋白質預測與分析

番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus ,MDRV)是番鴨“花肝病”的病原 ,屬于呼腸孤病毒科(Reoviri-dae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus).MDRV基因組為10個節段的雙股RNA ,根據核酸電泳遷移率的不同 ,可以分成3組:3個大基因節段(L1、L2、L3) ,3個中基因節段(M1、M2、M3) ,4個小基因節段(S1、S2、S3、S4)[1].

近年來 ,研究者對禽呼腸孤病毒(Avian reovirus ,ARV)S1基因進行了較為深入的研究.現已知 ,ARV的S1節段有3個ORF ,分別編碼三種蛋白質P10、P17和σC[2 ,3].其中σC是一種結構蛋白 ,與病毒吸附宿主細胞及病毒中和反應相關[4].而P10和P17為非結構蛋白 ,其中P10蛋白與細胞膜的融合關系密切[5].它在宿主細胞膜上形成孔蛋白而活化細胞融合作用 ,促進合胞體的形成 ,增加細胞膜的通透性 ,致使病毒顆粒更容易侵入細胞 ,從而加速了ARV的裂解性感染[3].Liu et al[6]通過對禽呼腸孤病毒等17個毒株的S1基因研究和對比 ,各地區ARV毒株之間的S1基因有較大的突變 ,同時證實了這3個蛋白都分別參與了病毒感染細胞的過程.與ARV相比 ,MDRV的S4基因編碼的蛋白缺失了1個非結構蛋白P17蛋白 ,只有1個非結構蛋白即P10蛋白.那么MDRV P10蛋白的生物學功能是否發生了改變 ,有待進一步的研究.

本研究對MDRV-YB株的P10基因進行了擴增、克隆和序列測定 ,分析了MDRV的P10基因分子結構特點和遺傳演變 ,并對其蛋白質性質和結構進行了分析比較 ,為進一步研究P10蛋白在MDRV致病性的作用 ,為闡明我國MDRV P10蛋白功能和分子流行病學研究提供基礎.

1 材料與方法

1.1 病毒、鴨胚

MDRV-YB株由本實驗室分離、鑒定和保存；番鴨種蛋購于溫氏(莆田)集團 ,經檢測MDRV陰性；番鴨胚成纖維細胞 ,按常規方法制備.

1.2 主要試劑

PGEM-T載體、RT-PCR試劑盒、質粒小提中量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、LB培養基、病毒RNA抽提試劑盒(DP315-R)、X-gal、IPTG、氨芐青霉素、限制性內切酶均購自Promega公司.

1.3 MDRV復蘇和RNA的提取

1.3.1 病毒復蘇 取保存的MDRV-YB株病毒原液0.4 mL ,0.22 μmol?L－1過濾器過濾 ,5日齡鴨胚卵黃囊接種 ,在接毒后5－7 d內整齊死亡后收集尿囊液.

1.3.2 病毒RNA提取 取140 μL尿囊液置于1.5 mL的RNA-Free EP管中 ,按照RNA抽提試劑盒說明書使用方法提取 ,步驟如下:向離心管中加入560 μL Carrier RNA工作液(配制方法按照說明書)；室溫(15－35℃)孵育10 min；加入560 μL無水乙醇 ,漩渦震蕩15 s；將630 μL液體轉移至RNase-Free吸附柱CR2 (試劑盒配) ,8000 r?min－1離心1 min ,棄廢液 ,吸附柱放回收集管；加入500 μL GD溶液(試劑盒配)至吸附柱CR2 ,8000 r?min－1離心1 min ,棄廢液 ,加入500 μL RW(試劑盒配) ,8000 r?min－1離心1 min ,棄廢液；將吸附柱放回收集管 ,12000 r?min－1離心3 min ,棄廢液 ,使吸附膜完全變干；將吸附柱放入一個RNase-free離心管 ,向吸附柱膜中央加入60 μL RNase-free ddH2O(試劑盒配)室溫放置5 min ,8000 r? min－1離心1 min.

1.4 P10蛋白基因的RT-PCR擴增

1.4.1 引物的設計與合成 參照GenBank中法國番鴨分離株(MDRV-89026)S4基因全長序列 ,采用Prim-er 5.0軟件設計引物如下(下劃線堿基為酶切位點):

該引物擴增產物306 bp(含目的基因288 bp＋18 bp酶切位點)的基因片段 ,由上海寶生物工程有限公司合成.

1.4.2 cDNA的合成及PCR擴增 參照RT-PCR試劑盒(promega ,A5001)說明進行cDNA第一鏈的合成和擴增.反轉錄體系為20 μL:RNA 2 μL；Oligo(dT)Primer 1 μL；Random Primer 1 μL；Go ScriptTM5X Reac-tion Buffer 4 μL；25 mmol?L－1MgCl2,2 μL；10 mmol?L－1PCR Nucleotide Mix ,1 μL；Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL；Go ScriptTMReverse Transcriptase 1 μL；Nuclease-Free Water 7.5 μL).反應條件:42℃15 min ,70℃15 min.cDNA于－20℃保存備用或直接進行PCR擴增.

PCR擴增反應條件如下 ,采用25 μL體系:cDNA 2 μL ,引物p1(10－12mol)1 μL ,引物p2(10－12mol)1 μL ,PCR Mix 12.5 μL ,Nuclease-Free Water加至25 μL.反應條件:95℃預變性5 min ,94℃變性1 min ,55℃退火30 s ,72℃延伸30 s ,共35個循環 ,最后72℃再延伸10 min ,4℃保存.

1.5 目的基因的克隆及序列測定

PCR產物經1%瓊脂糖電泳鑒定 ,用小量膠回收試劑盒回收P10基因PCR產物 ,回收的目的片段與pGEM-T載體分別用SalⅠ和NotⅠ進行雙酶切 ,酶切產物經膠回收后 ,于16℃恒溫水浴中反應連接10 h；將連接產物轉化到DH5α感受態宿主菌中培養 ,37℃200 r?min－1搖床培養60 min ,涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養基上 ,37℃培養12 h ,進行藍白斑篩選.挑取白色陽性菌落進行PCR鑒定 ,同時提取質粒 ,用SalⅠ和NotⅠ酶切鑒定雙酶切鑒定.將PCR和雙酶切鑒定均為陽性的菌落質粒送往寶生物工程(大連)有限公司進行測序.

1.6 P10基因序列比較分析及生物信息學分析

應用DNAStar軟件對測序結果進行拼接比對 ,登錄NCBI將MDRV-YB毒株P10蛋白基因序列與Genebank中發表的所有禽呼腸孤病毒(ARV、DRV、GRV)中的P10蛋白基因進行核苷酸序列及其推導的氨基酸序列同源性比較和遺傳進化樹分析.MDRV P10基因編碼蛋白結構預測采用ProtParam tool(http:// www.expasy.ch/cgi－bin/protparam)軟件進行；信號肽分析采用SignaIP 4.0 Server分析完成；N－糖基化位點預測和磷酸化位點預測分別采用NetNGLyc1.0 Server和NetPhos 2.0軟件分析；蛋白質疏水性、親水性采用在線分析軟件ProtScale進行(http://web.expasy.org/protscale/)分析；跨膜區域分析采用DNAMEND軟件分析完成；蛋白二級結構預測利用在線軟件GOR4(https://npsa－prabi.ibcp.fr/cgi－bin/npsa ＿automat.pl? page＝npsa＿gor4.html)完成.

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增、克隆與酶切鑒定

以MDRV-YB株的反轉錄cDNA為模板 ,用所設計的特異性引物進行RT-PCR擴增 ,1%凝膠電泳得到擴增大小約為306 bp的基因片段(圖1)與預期結果相符.

將擴增的目的基因與pGEM-T載體重組構建克隆載體 ,藍白篩選獲得陽性質粒 ,經PCR鑒定表明 ,能夠獲得目的基因 ,酶切鑒定結果表明 ,SalⅠ和NotⅠ雙酶切的重組質粒出現兩條特異帶 ,1條約3000 bp ,1條約300 bp(圖2) ,結果證明克隆載體構建成功.

圖1 p10基因引物p1 ,p2的PCR產物電泳Fig.1 Electrophoresis of amplified product of P10 gene by PCR

圖2 P10基因重組質粒酶切鑒定Fig.2 Electrophoresis of enzyme digestion of recombinant plasmids of P10 gene

2.2 P10基因序列的生物信息學分析

2.2.1 MDRV P10蛋白核苷酸序列與推導的氨基酸序列比較 將MDRV P10蛋白核苷酸序列與Genebank中發表的禽(雞、鴨、鵝)呼腸孤病毒(ARV、DRV、GRV)的P10蛋白核苷酸序列比對 ,發現福建MDRV-YB株與GeneBank等7株毒株鴨呼腸孤病毒株同源性在95%以上 ,其中與標準株法國MDRV-89026株同源性為95%；與41株禽(雞)呼腸孤病毒株(包括DRV-YJL和DRVYH株)毒株的同源性約為40% ,其中與標準毒株美國ARV-S1133株同源性為40.3%；與4株毒株鵝呼腸孤病毒株中的同源性在90%以上.經過對MDRV P10基因推導的氨基酸序列比對可知 ,MDRV P10蛋白氨基酸與法國株89026同源性為94.8% ,與福建株S12同源性98%；與ARV-S1133株同源性僅有21.9%；與鵝呼腸孤病毒D15株同源性94.8%.

經過對禽(雞)源、鴨(番鴨)源以及鵝源的代表株進行進化樹的分析 ,發現MDRV-YB毒株與福建株s4、S12、S14、815－12 ,浙江ZJ2000M株 ,法國株MDRV-89026、893307都屬于同一亞型；與同時分離到的YJL/YH兩株分屬于兩種亞型 ,YJL/YH株從進化樹來看 ,分屬于禽(雞)呼腸孤病毒亞型(圖3).由此可知 ,MDRVYB株與ARV毒株有很大變異 ,與水禽分離株保持高度同源.

圖3 MDRV P10基因與部分種間P10基因核苷酸序列遺傳進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of P10 gene between muscovy duck and other species

2.2.2 MDRV P10蛋白的基本性質 使用ProtParam tool在線軟件對MDRV P10蛋白的基本性質進行分析表明 ,該蛋白預測分子質量為10.7 ku ,包含有95個氨基酸 ,分子式為C484H750N130O138S3 ,理論等電點PI為5.6 ,Leu含量最高 ,達14.7% ,其次為Ser占11.6% ,不穩定系數為52.37.

2.2.3 信號肽分析 采用SignaIP 4.0 Server分析軟件對MDRV-YB株P10蛋白氨基酸序列進行潛在信號肽裂解位點預測 ,得知該氨基酸并不含有信號肽(圖4).

2.2.4 糖基化位點分析 采用NetNGLyc1.0 Server對MDRV P10蛋白進行N-糖基化位點預測 ,并未發現糖基化的位點.

2.2.5 磷酸化位點預測 使用軟件NetPhos 2.0預測到MDRV P10蛋白存在如下磷酸化位點:有4個絲氨酸(Ser)磷酸化位點(17 ,34 ,77 ,80) ,有1個絡氨酸(Tyr)磷酸化位點(9)(圖5).

圖4 MDRV P10氨基酸序列信號肽位點分析Fig.4 Amino acid signal peptide analysis

圖5 MDRV P10蛋白磷酸化位點預測Fig.5 The predicted phosphorylation site in protein of MDRV P10

2.2.6 MDRV P10蛋白疏水性、親水性及跨膜結構域分析 經ProtScale軟件分析可知MDRV P10蛋白的疏水性最高分值為2.5 ,親水性最高分為－2 ,整體而言MDRV P10蛋白的整條多肽鏈疏水性氨基酸多于親水性氨基酸 ,由此推測該蛋白屬于疏水性蛋白.與ARV-S1133株P10蛋白相比 ,ARV-S1133株P10蛋白有1個較大的疏水區 ,但整體而言其親水性值均高達－0.5以上(圖6).經DNAMEND軟件分析 ,MDRV P10氨基酸序列無明顯的跨膜區域 ,而ARV S1133 P10氨基酸序列卻有一個明顯的跨膜區(圖7).

圖6 MDRV P10與ARV P10蛋白疏水性分析圖Fig.6 The hydrophobicity analysis of MDRV P10 and ARV-S113 P10

圖7 MDRV P10和ARV P10蛋白跨膜區域分析圖Fig.7 The transmembrane analysis of ARV-S1133 P10 and MDRV P10

2.2.7 MDRV P10蛋白二級結構預測分析與比較 利用在線軟件GOR4預測到MDRV P10蛋白的二級結構為:α-螺旋區域24個氨基酸占25.26%；β-折疊區域22個氨基酸占23.16%；無規則卷曲區域49個氨基酸占51.58%.而ARV S1133 P10蛋白 ,α-螺旋區域34個氨基酸占34% ,β-折疊區域6個氨基酸占6.12% ,無規則卷曲區域58個氨基酸占59.18%.可見 ,MDRV YB的P10蛋白與ARV S1133 P10蛋白相比不僅在基因結構上發生了較大的變異 ,而且在蛋白質的結構上也發生了較大的變異.

3 討論

本實驗室于2000年從患病番鴨體內分離到多株MDRV ,其中MDRV-YB株和法國MDRV-89026株屬于同一分支 ,對番鴨具有很強的致病力.通過基因的遺傳進化分析可見 ,MDRV-YB株的毒力增強與P10蛋白的變異存在一定的關系.

通過生物學軟件對MDRV P10蛋白的性質分析可知 ,MDRV-YB株P10蛋白的性質并不夠穩定 ,這可能與亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)含量較高有關.同時 ,通過對MDRV信號肽裂解位點預測 ,未發現該氨基酸序列含有信號肽裂解位點 ,這與該蛋白質沒有N-糖基化位點有關.蛋白質末端的糖基化位是細胞識別蛋白的重要結構 ,在決定蛋白質的生物學功能發揮著重要的作用 ,如參與免疫防御 ,病毒復制 ,細胞生長等過程.同時 ,蛋白質的糖基化位點對蛋白質的構象穩定具有重要的影響.因此 ,該蛋白做為非結構蛋白 ,不易被宿主細胞識 ,有利于病毒的復制和免疫逃避.這也暗示著MDRV P10蛋白有被活化的可能 ,這或許與MDRV P10蛋白的功能上改變有關.

MDRV P10蛋白屬于疏水性蛋白 ,該蛋白沒有明顯的跨膜區 ,這與潘曉斌等[7]的研究一致.而ARV P10蛋白存在一個大的跨膜區 ,從蛋白質二級結構來看 ,二者在β-折疊區域存在相對較為明顯的區別 ,這些蛋白質結構上的變化可能與MDRV病毒致病性的改變存在一定的關系.多年來 ,對ARV P10蛋白的功能研究已經有一定的進展.Shmulevitz et al[5]研究表明 ,ARV P10非結構蛋白不相似于同類的膜融合蛋白 ,而是簡單的并且穩定的多聚體融合蛋白.ARV P10蛋白的肽鏈在功能上可以分為3個區域 ,即跨膜結構區域、近端保守二半胱氨酸序列區域和內膜基本區域[3].對以上3個區域分別進行突變并未使其喪失膜融合的功能 ,說明這些區域與膜結合的區域是非常緊密且廣泛的[8],秦春香等[9]在對禽呼腸孤病毒P10、P17非結構蛋白的研究中分析發現 ,突變的核苷酸多發生在氨基酸密碼子的第3位上 ,使得編碼的氨基酸基本上沒有改變 ,說明P10與P17蛋白基因多發生同義替換.這也可能說明了ARV P10蛋白已經進化成了幾個區域共同作用于細胞受體的機制.Shmulevitz et al[10]的研究還表明 ,ARV P10蛋白的二半胱氨酸序列是經過十六?；?,未經十六?；腜10蛋白會喪失膜結合的功能.ARV P10蛋白在病毒感染細胞時不是必要的 ,但與含有囊膜的病毒共同侵染細胞時 ,ARV P10則轉化成為必要的蛋白.Bodelon et al[11]研究表明 ,ARV P10蛋白能夠在細胞膜形成孔蛋白 ,借而發揮其融合的作用 ,促進被感染細胞的合胞體的形成 ,提高了宿主細胞膜的通透性 ,致使病毒顆粒更易于進入細胞 ,加快了ARV的感染進程[12].

從分析結果來看 ,MDRV與ARV的P10蛋白存在著顯著性的差異 ,更值得思考的是 ,ARV P10蛋白被證實是跨膜蛋白 ,具有膜融合的重要功能.但在MDRV中 ,P10蛋白是否也有著類似的重要功能?這些差異性表明MDRV P10蛋白可能扮演著與ARV P10不同的功能或者更為特別的功能 ,如自噬功能、協同侵染功能.雖然目前對禽呼腸孤病毒的分子生物學的研究已經有一定的進展和了解 ,但只是分別從各個基因和蛋白單方面進行研究 ,對各個蛋白之間的相互作用的研究并不完善.對于功能尚未明確的MDRV P10蛋白 ,通過本實驗 ,對于MDRV P10蛋白的結構分析及預測具有重要的意義 ,為進一步的P10蛋白功能驗證具有重要的指導作用.

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(責任編輯:吳顯達)

Cloning ,sequence analysis and predicted protein construction of MDRV P10 gene

CAI Yi-long ,ZHUANG Yu-bin ,ZHOU Wu-duo ,WANG Quan-xi ,QIU Xiao-dong ,WU Bao-cheng
(College of Animal Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Referring to the S4 gene sequences of Muscovy duck reovirus(MDRV) ,a pair of specific primer about the non-structural protein P10 gene was designed for RT-PCR.The target gene was amplified with MDRV-YB RNA template by RT-PCR ,thus P10 gene was cloned into PGEM-T vector.The positive plasmid was extracted and identified ,then was sequenced.The genetic evolution-ary tree was carried out by BLAST on net of NCBI ,and the predicted protein structure was analyzed by ProtParam software.The re-sults showed that the length of MDRV-YB P10 gene was 288 bp ,which encoded 95 amino acids.Compared with the standard strains of MDRV-89026 strain ,the homology was up to 95% ,while that was only 21.9%with ARV-S1133 strains.According to ProtParam software analysis ,the theoretical molecular weight of MDRV P10 gene was 10.7 ku without any signal peptide and glycosylation sites but with 4 Ser and 1 Tyr phosphorylation sites.In addition ,MDRV P10 was hydrophobic protein which was not transmembrane do-main.Protein secondary structure analysis showed that the amino acids composed with alpha helix and random curl was reduced ,but that of beta-fold was increased.Compared with ARV-S1133 P10 ,it is visual that the nonstructural protein P10 of MDRV has a large variation not only in gene levels ,but also in protein properties and structure ,which suggests that P10 may be related to MDRV viru-lence.

muscovy duck reovirus；non-structural protein P10；gene cloning；protein structure prediction and analysis

S851.3

A

1671-5470(2015)06-0606-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.008

2014－12－04

2015－01－21

國家自然科學基金-促進海峽兩岸科技合作聯合基金項目(U1305212)；福建省自然科學基金項目(2013J0169).

蔡一龍(1990年) ,男 ,碩士研究生.研究方向:預防獸醫.Email:cyl0207＠126.com.通訊作者吳寶成(1961年) ,男 ,研究員.研究方向:預防獸醫.Email:bc20020212＠163.com.